復(fù)方芪苓無糖顆粒對高脂致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

張 媛 徐 紅 楊汝春 周法根（指導(dǎo)） 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣興醫(yī)院 杭州 310007

侯小青 浙江中醫(yī)藥大學(xué)

·實(shí)驗(yàn)研究·

復(fù)方芪苓無糖顆粒對高脂致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

張 媛 徐 紅 楊汝春 周法根（指導(dǎo)） 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣興醫(yī)院 杭州 310007

侯小青 浙江中醫(yī)藥大學(xué)

目的：觀察復(fù)方芪苓無糖顆粒對高脂損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，探討其治療高脂血癥的作用機(jī)制。方法：用高脂血清造成人血管內(nèi)皮細(xì)胞（EVC）損傷模型，以復(fù)方芪苓無糖顆粒及血脂康含藥血清進(jìn)行干預(yù)。光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，MTT法檢測細(xì)胞活性；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測復(fù)方芪苓無糖顆粒高、中、低劑量各組對高脂血清誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子（TGF-β1）基因表達(dá)。結(jié)果：復(fù)方芪苓無糖顆粒各劑量組及血脂康組均能使高脂損傷的EVC形態(tài)趨于正常，活性增強(qiáng)，細(xì)胞膜損傷減輕；并均有上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1的趨勢，血脂康組TGF-β1表達(dá)與復(fù)方芪苓顆粒中、高濃度組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：復(fù)方芪苓無糖顆粒對高脂損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，可能是其防治高脂血癥及動脈粥樣硬化的作用機(jī)制之一。

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷 高脂血癥 復(fù)方芪苓無糖顆粒 轉(zhuǎn)化生長因子-β1

動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，諸多因素參與，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷作為始動環(huán)節(jié)已被公認(rèn)。本研究以高脂血清造成人血管內(nèi)皮細(xì)胞（EVC）損傷模型，以復(fù)方芪苓無糖顆粒及血脂康含藥血清進(jìn)行干預(yù)，觀察復(fù)方芪苓無糖顆粒對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 復(fù)方芪苓無糖顆粒（組成：黃芪、土茯苓、丹參、秦艽等；功效：健脾化痰，益氣活血）由杭州市中醫(yī)院制劑室提供；血脂康膠囊由北京北大維信生物科技有限公司生產(chǎn)；胰蛋白酶由GIBCO公司杭州吉諾生物公司分裝；M199培養(yǎng)液、胎牛血清、PBS緩沖液由杭州四季青公司提供；MTT、DMSO由美國SIGMA公司生產(chǎn)杭州達(dá)文生物公司分裝；Trizol試劑盒、10×PCR buffer、Taq酶、DNTP Mix、ICAM-1引物序列、TGF-β1引物序列、β-actin引物序列由上海生工生物有限公司提供。

1.2動物與細(xì)胞 清潔級成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量（160g±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證編號：SYXK（浙）2008-0115。細(xì)胞株由浙江中醫(yī)藥大學(xué)提供。

1.3 血清制備 成年雄性SD大鼠20只，常規(guī)飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分正常組、高脂組、復(fù)方芪苓顆粒組和血脂康組，每組5只。正常組大鼠予標(biāo)準(zhǔn)飼料，高脂組、復(fù)方芪苓顆粒組、血脂康組按高脂飼料配方（豬油15%+膽固醇6%+膽鹽3號2%+丙基硫氧嘧啶0.2%），10mL/kg的容量灌胃，每天1次（12：00）。第19天起復(fù)方芪苓顆粒組、血脂康組在灌高脂飼料的同時灌胃給藥，每天灌胃量分別為1.6g、0.25g，2mL/次，每天8、16時灌胃，共3天。各組大鼠連續(xù)灌胃21天，灌胃期間高脂組和藥物組大鼠自由攝取常規(guī)飼料，末次灌胃后1h從腹主動脈取血。離心后各取血清0.5mL送檢，檢測血脂水平，剩余血清超濾，56℃水浴滅活30min，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 用膠原酶消化法分離人血管內(nèi)皮細(xì)胞；加6mL含10%FCS的M199培養(yǎng)液將細(xì)胞打勻，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。吸凈培養(yǎng)液，用PBS沖洗1次，每瓶加入1mL10倍胰酶、3mL PBS；37℃、消化5～7min，用指尖輕叩瓶底，以細(xì)胞脫落瓶底為宜，加入含10%FCS的M199終止消化；用吸管將細(xì)胞充分吹打下來，轉(zhuǎn)移至15mL離心管，4℃、1 000轉(zhuǎn)離心5min；去上清，加入M199液洗滌1次，離心；去上清后，加入含10%FCS M199培養(yǎng)液10mL，吹打成細(xì)胞懸液，各取5mL分別加入50mL培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，2天換液1次，待細(xì)胞長到90%融合時傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)取第六代細(xì)胞。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 將接種細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組（10%正常大鼠血清）、高脂組（10%高脂大鼠血清）、復(fù)方芪苓無糖顆粒低濃度組（7.5%高脂血清和2.5%復(fù)方芪苓顆粒血清）、復(fù)方芪苓無糖顆粒中濃度組（5%高脂血清和5%復(fù)方芪苓顆粒血清）、復(fù)方芪苓無糖顆粒高濃度組（10%復(fù)方芪苓顆粒血清）、血脂康組（5%高脂血清和5%血脂康血清），每組設(shè)6個平行孔。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 EVC形態(tài)學(xué)觀察 各組藥物血清作用呈單層EVC 24h后，倒置顯微鏡下觀察EVC形態(tài)變化。

1.6.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖 將80%融合生長的內(nèi)皮細(xì)胞以10倍胰酶消化，收集細(xì)胞，含10%FCS的M199培養(yǎng)液稀釋后以2×104/L的密度接種于96孔板。正常培養(yǎng)24h后，洗去未貼壁細(xì)胞。換用無血清的M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。同步24h后換用含不同濃度高脂血清的M199培養(yǎng)液，即低濃度高脂血清刺激組：用7.5%正常大鼠血清和2.5%高脂血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)；中濃度高脂血清刺激組：用5%正常大鼠血清和5%高脂血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)；高濃度高脂血清刺激組：用10%高脂血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)。并設(shè)空白對照組（含10%正常大鼠血清的M199培養(yǎng)基）及調(diào)零孔（10%胎牛血清培養(yǎng)基、MTT、DMSO）。分別培養(yǎng)24h、48h后移出培養(yǎng)液，換入無血清M199培養(yǎng)液100μL/孔，并于每孔加MTT（5g/L）10μL。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔中加入DMSO100μL，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，并于酶聯(lián)免疫檢測儀490nm波長處檢測光密度值（OD值）。

1.6.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測TGF-β 1基因表達(dá) 依照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，根據(jù)康為逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA產(chǎn)物做模板擴(kuò)增TGF-β1產(chǎn)物。取PCR產(chǎn)物10μL，加入10×Loading Buffer 2μL，混勻后加到凝膠孔中，將電泳儀電壓調(diào)至80伏，電泳15～20min，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用 Bio Rad quan?ity one軟件對條帶進(jìn)行半定量分析,TGF-β1 mRNA的相對含量分別用其與β-actin特異性條帶的積分光密度比值表示。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA），組間用LSD法做比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)方芪苓無糖顆粒及血脂康對高脂血清處理的EVC形態(tài)學(xué)的影響 正常對照組細(xì)胞相差顯微鏡下為單層，互不重疊呈鋪石灰鑲嵌排列，細(xì)胞呈多角型，邊界清楚；高脂組細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞邊界不清，部分細(xì)胞脫落；復(fù)方芪苓及血脂康干預(yù)組細(xì)胞間隙變窄，形態(tài)趨于正常。

2.2 高脂血清對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 48h各濃度高脂血清刺激組與空白對照組比較，OD值無明顯變化（P＞0.05）；24h各濃度高脂血清刺激組與空白對照組比較，OD值明顯增加（P＜0.05）；高濃度組OD值增加最明顯，與低、中濃度組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 高脂血清對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 高脂血清對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與空白對照組比較，▲P＜0.05；與低、中濃度組比較，△P＜0.05

組別空白對照組低濃度高脂血清刺激組中濃度高脂血清刺激組高濃度高脂血清刺激組n5555 24h 1.45±0.03 1.48±0.09▲1.43±0.19▲1.76±0.11▲△48h 1.61±0.04 1.60±0.06 1.64±0.07 1.58±0.20

2.3 復(fù)方芪苓顆粒對高脂血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)的影響 高脂組與正常對照組比較TGF-β1顯著降低（P＜0.05）；復(fù)方芪苓顆粒低、中、高濃度組、血脂康組均有上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1的趨勢，中、高濃度組與高脂組比較，TGF-β1顯著升高（P＜0.05）；血脂康組能顯著上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β 1的含量（P＜0.05），見表2。

表2 復(fù)方芪苓顆粒對內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1 mRNA的影響（±s）

表2 復(fù)方芪苓顆粒對內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1 mRNA的影響（±s）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05；與高脂組比較，*P＜0.05

n TGF-β1/β-actin組別333333 0.18±0.03 0.08±0.03▲0.11±0.07▲0.23±0.05▲* 0.25±0.05▲* 0.23±0.08▲*正常對照組高脂組復(fù)方芪苓顆粒低濃度組復(fù)方芪苓顆粒中濃度組復(fù)方芪苓顆粒高濃度組血脂康組

3 討 論

已有研究證明，復(fù)方芪苓顆粒能顯著降低高脂血癥大鼠TC、TG及LDL-C，提高HDL-C[1]；復(fù)方芪苓顆粒含藥血清能顯著抑制TNF-α刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞 ICAM-1 mRNA的表達(dá) ，從基因水平闡明了復(fù)方芪苓顆粒對TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1 mRNA的表達(dá)的抑制作用,從體外實(shí)驗(yàn)證明復(fù)方芪苓顆粒含藥血清抑制 ICAM-1表達(dá)的作用是減輕 TNF-α誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的機(jī)制之一[2]。本實(shí)驗(yàn)以高脂血清作用于EVC，造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，光鏡下可見細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞邊界不清，部分細(xì)胞脫落；而復(fù)方芪苓無糖顆粒各劑量組及血脂康組可以使高脂血清造成的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變趨于正常。MTT比色法測定EVC活性結(jié)果表明，高脂血清明顯抑制EVC的活性。TGF-β1是TGF-β眾多成員中的一種，在哺乳動物體細(xì)胞中所含的比例最高（＞90%）、活性最強(qiáng)，與疾病關(guān)系最密切。目前普遍認(rèn)為TGF-β1是AS的保護(hù)性細(xì)胞因子。研究[3]表明，TGF-β1在心血管方面的主要生物作用有：①對血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及增殖呈促進(jìn)或抑制的雙相性；②調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，增加纖維連接蛋白、蛋白聚糖和膠原蛋白合成，阻止基質(zhì)蛋白降解。所以，TGF-β1在動脈硬化過程中作用是雙向性的，既抑制動脈粥樣斑塊又有參與再狹窄的可能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方芪苓無糖顆粒中、高濃度干預(yù)組TGF-β1較高脂組均有顯著提高，提示中藥復(fù)方芪苓無糖顆?？赡芡ㄟ^提高內(nèi)皮細(xì)胞TGF-β1的含量降低高脂環(huán)境下巨噬細(xì)胞的表達(dá)，從而降低清道夫受體的表達(dá)，使膽固醇成分減少，上調(diào)ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)載體使膽固醇外流增加，同時抑制由氧化的極低密度脂蛋白殘基誘發(fā)的泡沫細(xì)胞的形成，起到抗粥樣硬化的作用。

［1］徐紅，張媛，楊汝春，等.復(fù)方芪苓無糖顆粒劑對高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝紊亂調(diào)節(jié)的研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（11）：2982-2985.

［2］徐紅，楊汝春，王軍，等.尿酸利仙含藥血清對TNF-α誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1基因表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2006.8，24（8）：1451.

［3］鄭瓊莉，祝煒，賈晶，等.轉(zhuǎn)化生長因子β1與心血管疾?。跩］.中國心血管病研究志雜，2006，4（7）：550-551.

ProtectiveEffectsofSugar-freeQilingCompoundGranulesonEndothelialVascularCellsAgainstInju?riesInducedbyHyperlipidemicSerum

Z HANGY u a n,XUH o n g,HOU X i a o-q i n g,e t a l.G u a n g x i n g H o s p i t a l Affiliated to Zhejiang Traditional Chinese Medicine University,Hangzhou(310007)，China

Objective:To study the protective effect of sugar-free Qiling compound granules on endothelial vascu?lar cells(EVC)against injuries by hyperlipidemic serum,in an attempt to understand the underlying mechanism of sugar-free Qiling compound granules in treating hyperlipidemia.M ethods:Hyperlipidemic serum was used to establish injured model of EVC.Sera with sugar-free Qiling compound granules of low,medium,high concentra?tions and Xuezhikang were applied with hyperlipidemic serum together.The morphologic changes of EVC were ob?served under light microscope and EVC activity was determined by MTT method.Reverse transcription-poly?merase chain reaction(RT-PCR)technique was used to detect hyperlipidemia induced EVC surface adhesion mole?cule(TGF-β1)gene expression in 3 Qiling groups.Results:After treatment of 3 doses of Qiling compound and Xuezhikang,abnormal morphologic changes of EVC induced by hyperlipidemic serum gradually retained to nor?mal,the activity of EVC increased,and the injury of cell membrane lessened.The mRNA’s expression of TGF-β 1 in all groups increased after treatment and the expression was not statistically different between the Xuezhi?kang group and the sugar-free Qiling groups with medium and high concentrations(P＞0.05).Conclusion:Sug?ar-free Qiling compound granules have a protective effect on EVC against injuries induced by hyperlipidemic se?rum and can be used as prevention and treatment for hyperlipidemia and atherosclerosis ideal medication.

endothelial vascular cell injury hyperlipidemia sugar-free Qiling compound granules transforming growth factor-β1

2012-10-25

浙江省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（No.2008CA080）

張媛，E-mail：xiamo0405@msn.com.