植物乳桿菌ST－ⅢproU基因簇的克隆、表達(dá)

趙山山，張秋香，劉小鳴，郝光飛，趙建新，陳永泉，張 灝，陳 衛(wèi)

(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122)

乳桿菌長(zhǎng)期以來(lái)被用于食品發(fā)酵工業(yè)中，乳桿菌屬包括超過50個(gè)不同的種，是乳酸菌中最大的屬之一［1－2］。在發(fā)酵過程，如發(fā)酵干酪［3］、香腸［4］、魚［5］、醬油［6］、蔬菜［7］以及食品保藏中乳桿菌經(jīng)常會(huì)遇到高鹽環(huán)境，高鹽濃度引起的高滲透壓會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和生理上的損傷［8－9］，因此乳桿菌在高滲環(huán)境中存活、生長(zhǎng)、代謝的能力對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要。分離自泡菜中的商業(yè)化菌株植物乳桿菌 ST－Ⅲ(Lactobacillus plantarum ST－Ⅲ)［10］，具有很強(qiáng)的耐鹽能力，甚至可以在含鹽量高達(dá)8%的環(huán)境中生長(zhǎng)。通過對(duì)植物乳桿菌ST－Ⅲ的全基因組測(cè)序和基因注釋發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ST－Ⅲ的基因組中存在多個(gè)與相容性溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體［11］，在其獨(dú)有的質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)了基因簇proU［12］，proU 含有 3 個(gè)開放閱讀框，分別為 proX(LPST_P0028)、proW(LPST_P0029)及 proV(LPST_P0030)。Kanstantsin等人［13］發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的基因簇proU編碼的蛋白通過向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)甘氨酸甜菜堿、脯氨酸甜菜堿來(lái)應(yīng)對(duì)外界滲透壓的升高。由此推測(cè)，植物乳桿菌ST－Ⅲ所具有的較為突出的耐鹽能力可能與其特有的質(zhì)粒上的基因簇proU及其包含的3個(gè)基因有關(guān)。

乳酸乳球菌乳脂亞種比乳酸亞種對(duì)滲透壓力更敏感［14］，乳酸亞種可以在鹽濃度為4%(w/v)的環(huán)境下生長(zhǎng)，而多數(shù)乳酸乳球菌乳脂亞種只能在鹽濃度為2%及以下的環(huán)境中生長(zhǎng)。為了研究基因簇proU在植物乳桿菌ST－Ⅲ耐鹽中的作用，將其整個(gè)基因簇及其包含單個(gè)基因分別克隆到了耐鹽能力較低的乳酸乳球菌NZ9000(Lactococcus lactis subsp.cremoris NZ9000)中，對(duì)基因簇proU進(jìn)行功能驗(yàn)證。研究與乳桿菌耐鹽能力相關(guān)的基因，為挖掘其益生功能奠定了基礎(chǔ)，對(duì)乳桿菌的工業(yè)應(yīng)用具有重要的意義。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌ST－Ⅲ、乳酸乳球菌NZ9000及載體pNZ8148 本實(shí)驗(yàn)室保存;KOD plus高保真DNA聚合酶、dNTP Takara公司產(chǎn)品;T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶NcoI、BspHI、SacI NEB公司產(chǎn)品;甜菜堿、Nisin Sigma公司產(chǎn)品;氯霉素 上海生物工程有限公司產(chǎn)品;Trizol試劑 Invitrogen公司產(chǎn)品;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent kit)Takara公司產(chǎn)品;質(zhì)粒小提取試劑盒 Solarbio公司產(chǎn)品;熒光定量PCR(RT－PCR)試劑盒(Power SYBR Green PCR Master Mix)Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

Electropotator 2510型電轉(zhuǎn)化儀、1mm電擊轉(zhuǎn)化杯 Eppendorf公司;ABI－Prism 7300sequence detection system型熒光定量PCR儀 Applied Biosystems公司;UV－2450型分光光度儀 Shimadzu公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基及生長(zhǎng)條件 植物乳桿菌ST－Ⅲ于MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng) 12h;乳酸乳球菌NZ9000于GM17培養(yǎng)基(M17培養(yǎng)基，0.5%葡萄糖)中，30℃靜置培養(yǎng)12h。耐鹽實(shí)驗(yàn)中重組菌株在化學(xué)成分確定培養(yǎng)基(CDM)［15］中30℃靜置培養(yǎng)22.5h。

1.2.2 基因進(jìn)化分析 通過BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)軟件將 proX(GI:308183779)、proW(GI:308183780)、proV(GI:308183781)序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)，并選取相似性較高的序列用ClustalX V2.0進(jìn)行分析，用MEGA3.1進(jìn)行核酸序列同源性分析，NJ法(neighbor joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)目的基因proX、proW、proV及proU的序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以植物乳桿菌ST－Ⅲ的基因組DNA為模板擴(kuò)增得到基因proX、proW和proV，基因的大小分別約為 918、804、1200bp，純化擴(kuò)增產(chǎn)物。質(zhì)粒pNZ8148與proX、proW分別用NcoI和SacI進(jìn)行雙酶切，proU，proV用BspHI和SacI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后在16℃下過夜進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌NZ9000，電擊條件為電容25μF，電阻200Ω，電壓2000V，電機(jī)時(shí)間2.5～3.0ms。轉(zhuǎn)化菌液涂布于含有氯霉素的GM17平板，30℃過夜培養(yǎng)。隨機(jī)挑取選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒DNA為模板擴(kuò)增目的基因進(jìn)行驗(yàn)證。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過純化后，送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及驗(yàn)證 挑取測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子接種到氯霉素終濃為10μg/mL的GM17液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)過夜。按照2%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接于含有氯霉素的GM17培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600達(dá)到0.5～0.6時(shí)，以終濃度為10ng/mL的nisin在30℃誘導(dǎo)6h后［16］，5000r/min離心5min收集菌體。液氮研磨菌體后用Trizol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，分別以proX、proW、proV和16S rDNA基因設(shè)計(jì)的RT－PCR引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL:SYBR Green PCR 混合液 10μL，正、反向引物各0.5μL，cDNA 或無(wú)菌水(陰性對(duì)照)1μL，無(wú)菌水8μL。RT－PCR 程序?yàn)?50℃ 2min，95℃ 10min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后95℃ 15s，60℃ 30s。選擇16S rDNA基因?yàn)閮?nèi)參，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)基因分別做3個(gè)平行。

1.2.5 重組菌株耐鹽能力的測(cè)定 重組菌株在10μg/mL氯霉素的CDM液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)。經(jīng)nisin誘導(dǎo)表達(dá)后以2%的接種量分別接入新鮮的含有3%NaCl(w/v)及10ng/mL nisin的CDM培養(yǎng)基，CDM中添加終濃度為1mmol/L的甜菜堿，同時(shí)以不添加甜菜堿的為對(duì)照。每2.5h測(cè)定菌液的吸光值，繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因進(jìn)化分析

根據(jù)NJ發(fā)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖1。植物乳桿菌ST－Ⅲ的基因簇proU包含的3個(gè)基因proX、proW、proV均與戊糖乳桿菌 IG1(Lactobacillus peutosus IG1)相似性最高，達(dá)到100%。Ricciardi等人研究［17］發(fā)現(xiàn)戊糖乳桿菌有較高的耐鹽能力，鑒于植物乳桿菌ST－Ⅲ的基因簇proU包含的這3個(gè)基因與戊糖乳桿菌IG1的對(duì)應(yīng)基因發(fā)育地位相近，由此推測(cè)植物乳桿菌ST－Ⅲ的基因簇proU及其包含的3個(gè)基因proX、proW、proV可能是與其耐鹽能力相關(guān)的基因。

圖1 基于目的序列proX、proW、proV的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Neighbour joining phylogenetic tree showing the phylogenetic position of proX，proW，proV

2.2 質(zhì)粒的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增得到的基因proX、proW、proV及proU分別克隆至質(zhì)粒pNZ8148中的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建得到4個(gè)重組質(zhì)粒:pNZ8148－proX、pNZ8148－proW、pNZ8148－proV及pNZ8148－proU。電擊轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌NZ9000中，在含有氯霉素的GM17抗性平板上隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化子單克隆菌落，抽提質(zhì)粒DNA并進(jìn)行PCR鑒定(圖2)。擴(kuò)增得到的proU基因大小約為3022bp，proX、proW和 proV基因的大小分別約為918、804、1200bp，均與基因?qū)嶋H大小相符合。進(jìn)一步將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果符合預(yù)期(結(jié)果未列出)，表明乳酸乳球菌重組表達(dá)質(zhì)粒pNZ8148－proX、pNZ8148－proW、pNZ8148－proV 及pNZ8148－proU構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR identification of recombination plasmids

2.3 RT－PCR 分析

為了驗(yàn)證插入基因是否在重組菌中表達(dá)，以插入空質(zhì)粒的乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)為對(duì)照菌株，利用RT－PCR技術(shù)檢測(cè)proX、proW、proV在乳酸乳球菌中的表達(dá)量。如圖3所示，基因proX、proW、proV在乳酸乳球菌中經(jīng)nisin誘導(dǎo)后的表達(dá)量與對(duì)照菌株相比分別提高了197、106、170倍。而將整個(gè)proU基因簇克隆表達(dá)到乳酸菌球菌NZ9000中，表達(dá)量與對(duì)照菌株的表達(dá)量相比提高了113倍。由此說明，經(jīng)過nisin誘導(dǎo)，基因proX、proW、proV及proU在乳酸乳球菌中成功表達(dá)。

2.4 重組菌株耐鹽生長(zhǎng)曲線

為驗(yàn)證基因簇proU在耐鹽中的作用，在鹽濃度為3%的CDM中測(cè)定重組菌株的生長(zhǎng)曲線。由圖4可以看出:原始菌株乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)無(wú)論在是否含有甜菜堿的CDM中均不生長(zhǎng);在不含有甜菜堿的CDM中培養(yǎng)的重組菌株的生長(zhǎng)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于在含有甜菜堿的CDM中培養(yǎng)的重組菌株;在甜菜堿存在下培養(yǎng)的重組菌株乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148－proU)、乳酸乳球菌 NZ9000(pNZ8148－proX)、乳酸乳球菌 NZ9000(pNZ8148－proW)、乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148－proV)它們的耐鹽能力均比乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)的耐鹽能力強(qiáng)。由此可見，誘導(dǎo)表達(dá)與甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因簇proU及其包含的基因，均提高了重組菌株的耐鹽能力，使原本不能在鹽濃度為3%的CDM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)可以在3%鹽濃度下生長(zhǎng)，并且重組菌株通過轉(zhuǎn)運(yùn)甜菜堿提高了菌株的耐鹽能力。

圖3 qRT－PCR分析重組菌株誘導(dǎo)后proX、proW、proV、proU基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 qRT－PCR analysis of proX、proW、proV、proU genes transcription

圖4 重組菌株耐鹽生長(zhǎng)曲線。Fig.4 Growth curve of recombinant strain in CDM with salt

3 結(jié)論

插入基因簇proU及其包含的3個(gè)基因proX，proW，proV的重組菌株乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148－proU)、NZ9000(pNZ8148－proX)、NZ9000(pNZ8148－proW)及NZ9000(pNZ8148－proV)的耐鹽能力均優(yōu)于對(duì)照菌株乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)，均能夠在含有甜菜堿的鹽濃度為3%的環(huán)境下生長(zhǎng);且插入完整基因簇proU的重組菌株耐鹽能力最強(qiáng)，說明整個(gè)基因簇包含的3個(gè)基因同時(shí)存在時(shí)更有利于提高對(duì)乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)的耐鹽能力。插入基因proW和proV的重組菌株耐鹽能力次之，插入基因proX的重組菌株耐鹽能力最弱，但均優(yōu)于對(duì)照菌株乳酸乳球菌NZ9000(pNZ8148)，說明插入基因簇proU包含的單個(gè)基因也可提高乳酸乳球菌NZ9000的耐鹽能力。綜上所述，本研究結(jié)果表明來(lái)源于植物乳桿菌ST－Ⅲ特有質(zhì)粒上的基因簇proU及其包含的3個(gè)基因是與耐鹽相關(guān)的基因。

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