蘇芡種殼棕色素的提取及紅外光譜分析

張曉云，盧 昊，王海剛，翟鑫宇，鄭漓波，張雪婧

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

蘇芡又名“南芡”、“南蕩雞頭”等，為睡蓮科芡屬無刺芡栽培種，原產(chǎn)于我國江蘇省蘇州市。與北芡(刺芡)相比，其種仁粒大、圓整，煮食糯性、營養(yǎng)豐富、產(chǎn)量高，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是目前國內(nèi)唯一的優(yōu)質(zhì)芡實(shí)栽培品種。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國“蘇芡”栽種面積已超過10萬畝［1］。目前，對蘇芡產(chǎn)品的研究開發(fā)主要是一些粗加工的芡實(shí)米、芡實(shí)醬菜和以芡實(shí)莖根作原料的食用蔬菜［2］，對其堅(jiān)硬種殼(約占其種子質(zhì)量的30%～40%)的開發(fā)利用尚很欠缺，通常情況下被廢棄或作普通燃料，不僅浪費(fèi)資源，而且污染環(huán)境。研究表明，芡實(shí)種殼中含有較多的棕色素，其主要成分通常為多元酚類物質(zhì)［3］;而多酚類物質(zhì)由于特有的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性使其具有抗腫瘤、抗氧化以及抗菌等多種生理功能［4－5］，已廣泛被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、日用化工等相關(guān)領(lǐng)域［6］。本文以蘇芡種殼為原料，選擇合適的溶劑提取其棕色素，經(jīng)分離純化后分別用紅外光譜儀對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定分析，為今后進(jìn)一步綜合開發(fā)利用蘇芡資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘇芡種殼 購自蘇州，經(jīng)40℃烘干后用超微粉碎機(jī)粉碎過80目篩后備用;鹽酸、NaOH、無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯等 均為分析純。

TGL－16M高速臺式冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;SHZ－10組合式水浴搖床 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;GZX－9240 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Cary 100紫外可見分光光度計(jì) 美國瓦里安公司;ATAVAR型傅立葉變換紅外(FT－IR) 美國Nicolet公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 棕色素提取劑的選擇 分別稱取1.0g粉碎蘇芡種殼，按照料液比1∶25加入蒸餾水、1%HCl、2%NaOH、50%乙醇、無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯等不同提取劑，室溫下振蕩提取2h后經(jīng)10000r/min離心10min，收集上清液定容至250mL備用。

將上述不同棕色素提取液分別通過全波長掃描確定其最大吸收波長，然后測定各提取液(稀釋5倍)在其最大吸收波長處的吸光度，進(jìn)行比較。

1.2.2 棕色素提取條件的優(yōu)化

1.2.2.1 料液比對提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取1.0g粉碎蘇芡種殼，分別按照料液比(蘇芡種殼:2%NaOH)1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 于錐形瓶中60℃下振蕩提取2h后，經(jīng)10000r/min離心10min。收集上清液定容至250mL，再稀釋10倍于419nm處測定其吸光度。

1.2.2.2 時(shí)間對提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取1.0g粉碎蘇芡種殼，按照料液比(蘇芡種殼∶2%NaOH)1∶25加入錐形瓶中。在60℃條件下分別振蕩提取1、2、3、4、5、6h，經(jīng) 10000r/min 離心 10min。收集上清液定容至250mL，再稀釋10倍于419nm處測定其吸光度。

1.2.2.3 溫度對提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取1.0g粉碎蘇芡種殼，按照料液比(蘇芡種殼∶2%NaOH)1∶25加入錐形瓶中。在 30、40、50、60、70、80℃條件下分別振蕩提取2h，經(jīng)10000r/min離心10min。收集上清液定容至250mL，再稀釋10倍于419nm處測定其吸光度。

1.2.2.4 最佳提取工藝條件的確定 選取溫度、時(shí)間、料液比為考察因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平(見表1)，用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)，對棕色素提取條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，篩選最佳工藝。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design

1.2.3 棕色素的純化與紅外光譜分析

1.2.3.1 棕色素粗制品的制備與純化 稱取100g粉碎蘇芡種殼，按照料液比 1∶30(蘇芡種皮∶2%NaOH)，60℃下振蕩提取3h后經(jīng)10000r/min離心分離10min。將上清液經(jīng)減壓濃縮后分兩等份分別經(jīng)方法Ⅰ(酸沉法)和方法Ⅱ(醇沉法)進(jìn)行純化處理［7］。

方法Ⅰ:取上述棕色素粗提取液于離心管中，邊搖邊滴加3mol/L HCl至出現(xiàn)渾濁時(shí)，放置冰箱中1h，經(jīng)10000r/min離心分離10min。向得到的沉淀物滴加0.1mol/L NaOH至沉淀剛?cè)芙?，如此重結(jié)晶三次。將沉淀物于50℃干燥，得純化棕色素Ⅰ。

方法Ⅱ:取上述棕色素粗提取液于離心管中，邊搖邊滴加無水乙醇，直至棕色素溶液沉淀完全時(shí)置于冰箱中充分沉淀1h，經(jīng)10000r/min離心分離10min。將沉淀物于50℃干燥，得純化棕色素Ⅱ。

1.2.3.2 棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ的紅外光譜分析 分別取適量經(jīng)105℃干燥6h后的棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ，加入無水溴化鉀粉末，用研缽充分磨細(xì)、混勻、裝模，置于壓片機(jī)上抽真空2min，加壓至100000N/cm2，受壓10min，把樣品壓成0.1～1.0mm厚的芯片。將芯片置于紅外光譜儀的樣品光路中，波數(shù)范圍為400～4000cm－1，記錄其IR數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對棕色素提取效果比較

為準(zhǔn)確比較甲醇、乙酸乙酯、乙醇、鹽酸等不同提取劑對蘇芡種殼中棕色素的提取效果，分別測定各不同溶劑提取液在其最大吸收波長處的吸光度，結(jié)果見表2所示。

表2 不同溶劑提取棕色素的吸光度比較Table 2 Adsorption of different solvents on extraction of brown pigment

由表2可以看出，用2%NaOH溶液對蘇芡種殼中棕色素的提取效果最好，其次是水和50%乙醇，甲醇、乙酸乙酯、無水乙醇、1%鹽酸對蘇芡種殼棕色素的提取能力較差。綜合考慮，選擇2%NaOH溶液為提取劑。

2.2 各因素對棕色素提取效果的影響

2.2.1 料液比對提取效果的影響 如圖1所示，增加料液比可顯著提高對蘇芡種殼棕色素的提取效果，但料液比增加到1∶25以后，繼續(xù)增加料液比不能帶來提取效果的顯著性增加。所以從提取效果和節(jié)約成本兩方面考慮，確定料液比在1∶20～1∶30比較適宜。

圖1 料液比對棕色素提取效果的影響Fig.1 Influence of material－liquid ratio on the extraction effect of brown pigment

2.2.2 提取時(shí)間對提取效果的影響 由圖2可以看出，提取時(shí)間在2h內(nèi)，提取液吸光度隨著時(shí)間延長增加;當(dāng)提取時(shí)間超過2h，吸光度隨著提取時(shí)間的增加反而出現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于棕色素在該提取條件下不穩(wěn)定，隨著提取時(shí)間增加出現(xiàn)了少量分解所致［8］。因此，選擇提取時(shí)間為2h左右較為適宜。

圖2 提取時(shí)間對棕色素提取效果的影響Fig.2 Influence of extracting time on the extraction effect of brown pigment

2.2.3 提取溫度對提取效果的影響 如圖3所示，隨著提取溫度的升高，提取液吸光度值增加，但超過40℃后吸光度值增加幅度減小。根據(jù)文獻(xiàn)［9－10］研究報(bào)道，棕色素在溫度80℃以上時(shí)不穩(wěn)定，可能會導(dǎo)致色素分子結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的變化。因此，提取溫度選擇在40～60℃。

圖3 提取溫度對棕色素提取效果的影響Fig.3 Influence of extracting temperature on the extraction effect of brown pigment

2.2.4 色素最佳提取條件的確定 按照表1因素水平條件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，各因素對蘇芡種殼中棕色素提取效果的影響順序?yàn)?提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比。實(shí)驗(yàn)條件A3B3C2即提取溫度為60℃、提取時(shí)間為3h、料液比為1∶25對蘇芡種殼中棕色素的提取效果較好。為進(jìn)一步確認(rèn)棕色素的最佳提取條件，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果，選取實(shí)驗(yàn)條件 A3B3C2和A3B3C3進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明A3B3C2條件下蘇芡種殼棕色素提取液的吸光度值為0.860，A3B3C3條件下的吸光度值為0.871。綜合考慮，確定蘇芡種殼中棕色素的最適提取條件為 A3B3C3，即提取溫度為60℃、提取時(shí)間為 3h、料液比為 1∶30。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Table 3 Result analysis of orthogonal experimental design

2.3 蘇芡種殼棕色素的紅外光譜分析

圖4是經(jīng)酸沉法和醇沉法得到的棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ的紅外光譜圖。由圖4可見，兩種棕色素的波形和波數(shù)存在一定差異。二者在3390.30cm－1處均有一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，這是酚類物質(zhì)的重要特征，是由O－H伸縮振動引起的吸收峰;在 1633.44、1456.02、1338.38cm－1均出現(xiàn)略強(qiáng)的吸收峰，其中1633.44cm－1處為芳香環(huán)的伸縮振動峰;在3043.17、2989.17、1112.74、1051.31cm－1處均出現(xiàn)較小的吸收峰。二者差異主要在于:棕色素Ⅰ在 2925.53、2854.18、1716.36、1234.24cm－1處出現(xiàn)強(qiáng)弱不等的吸收峰，主要是亞甲基和酯羰基的伸縮振動峰，C－N和N－H的伸縮振動峰;棕色素Ⅱ在867.82、815.75、777.18cm－1處出現(xiàn)強(qiáng)弱不等吸收峰，主要是芳香環(huán)的一取代面外彎曲振動峰。

圖4 棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ的紅外光譜圖Fig.4 IR spectrogram of pigmentⅠand pigmentⅡ

紅外光譜分析可知，蘇芡種殼棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ的結(jié)構(gòu)中均存在芳香環(huán)，棕色素Ⅰ中存在著酯羰基結(jié)構(gòu)，且具有C－N，而棕色素Ⅱ中不存在這些結(jié)構(gòu)，但其芳香環(huán)上具有棕色素Ⅰ沒有的取代基。對于蘇芡種殼棕色素的具體主要組成，尚需進(jìn)一步采用合適的方法如高效毛細(xì)管電泳、高效液相色譜法、高速逆流色譜、質(zhì)譜和核磁共振譜等［11］對其主要成分進(jìn)行進(jìn)一步分離和結(jié)構(gòu)確認(rèn)。

3 結(jié)論

3.1 與50%乙醇、甲醇、乙酸乙酯、無水乙醇、1%鹽酸等提取劑相比，2%NaOH溶液對蘇芡種殼中棕色素的提取效果較好。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過實(shí)驗(yàn)綜合確定用2%NaOH溶液提取蘇芡種殼中棕色素的最佳條件為:料液比1∶30，提取溫度60℃，提取時(shí)間3h。

3.2 對提取的棕色素利用酸沉法和醇沉法分別進(jìn)行純化處理得到的棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ。紅外分析表明棕色素Ⅰ和棕色素Ⅱ結(jié)構(gòu)中均存在芳香環(huán)。但棕色素Ⅰ中存在著酯羰基和C－N結(jié)構(gòu);而棕色素Ⅱ中不存在這些結(jié)構(gòu)，其芳香環(huán)上具有棕色素Ⅰ沒有的取代基。對于蘇芡種殼棕色素的具體主要組成尚需進(jìn)一步采用合適的方法進(jìn)行分離和確認(rèn)。

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