木瓜蛋白酶酶解谷朊粉制備抗氧化多肽的研究

劉樹興，喬曉林

(陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安710021)

谷朊粉(Vital wheat gluten)又稱活性小麥面筋蛋白，是營養(yǎng)豐富、物美價廉、氨基酸組成齊全的純天然植物性蛋白源，是小麥淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量達70%以上。含有較多的疏水性氨基酸和一定數(shù)量的堿性氨基酸，具良好的成膜性、延展性和吸水乳化性等特點，在食品添加劑中作為面粉改良劑和營養(yǎng)強化劑已有廣泛的用途［1－4］，而對于谷朊粉的綜合利用和功能開發(fā)還有待深入研究。生物活性肽(Bioactive peptides，BAP)來源廣泛，目前已成為世界范圍內(nèi)的研究熱點。特別是抗氧化肽，它具有消除自由基、抑制或減緩氧化反應的特點，可用于改善食品品質(zhì)、延長食品的保質(zhì)期，減輕生物體內(nèi)自由基對機體的損傷等。近年來，由于化學抗氧化添加劑的不安全性，高效低毒的天然食品抗氧化劑已成為目前研究的一大熱點。抗氧化肽可以抑制體內(nèi)自由鐵離子、血紅蛋白、脂氧合酶和體外單線態(tài)氧催化的脂肪酸敗作用，也能抑制多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)的活性以及可直接與PPO的催化產(chǎn)物醌作用阻止黑色多聚氧化物的形成，降低酶促反應的速度。同時還具有重金屬清道夫和過氧化氫分解促進劑作用，可降低自氧化速率，減少脂肪過氧化氫含量，減少自由基生成，在動物飼料和人類食品市場中具有巨大的開發(fā)前景。國外相關報道表明，通過酶解小麥蛋白可獲得生物活性肽(如阿片肽和抗氧化肽等)［5－8］。而國內(nèi)對此方面的研究仍處于初級階段。雖有類似研究報道，但工藝條件相對復雜，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。本研究采用木瓜蛋白酶對小麥面筋蛋白進行酶法降解制備抗氧化活性粗肽，并對其工藝條件進行優(yōu)化，以DPPH自由基清除率及多肽含量為判定指標，以獲得具有較高抗氧化活性的酶解產(chǎn)物，進一步利用單因素實驗結(jié)合正交實驗，確定該酶對小麥面筋蛋白的最適作用條件。以期為谷朊粉制備抗氧化肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，拓寬谷朊粉的應用范圍，提高其生產(chǎn)附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷朊粉 陜西咸陽面粉廠;木瓜蛋白酶0.5～2U/mg solid、酪蛋白(純度為80%)Sigma公司;雙縮脲試劑、氫氧化鈉、三氯乙酸等 分析純試劑，天津市天力化學試劑有限公司。

UV－2600/2600A紫外可見分光光度計 龍尼柯(上海)儀器有限公司;BS245分析天平、PB－10型精密酸度計 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;78－1型磁力加熱攪拌器 杭州儀表電機廠;SC－3610低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co，Lid;HH－S6 型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉水興儀器有限公司;KDN－04C型數(shù)顯消化爐、KDN－04C型凱氏定氮儀上海洪紀儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 谷朊粉理化特性測定 含水量的測定:105℃恒重法［9］;粗蛋白含量的測定:微量凱氏定氮法［10］;灰分含量的測定:灼燒法［11］;粗脂肪含量測定:酸水解法［12］;碳水化合物測定:DNS 比色法［13］。

1.2.2 多肽含量測定 配制質(zhì)量濃度為10mg/mL的酪蛋白，分別吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 于試管中，用蒸餾水補足到1mL，加4mL雙縮脲試劑，于波長540nm處進行比色，以吸光度值為橫坐標，酪蛋白濃度為縱坐標，繪制標準曲線。得到線性回歸方程為y=0.049x+0.002(R2=0.999)。將待測蛋白吸光度值代入標準曲線，可求出待測蛋白的含量［14］。

取水解液10mL，加入10%的三氯乙酸溶液10mL與之混合反應，放置30min，在3500r/min下離心10min，用雙縮脲法測定上清液中可溶性蛋白質(zhì)濃度，即可計算出多肽的濃度［15］。

1.2.3 DPPH自由基清除率的測定［16－17］取待測液及等體積0.2mmol/L DPPH溶液加入同一具塞試管中，搖勻，30min后用無水乙醇作參比測定其吸光度Ai，同時測定0.2mmol/L DPPH溶液與等體積無水乙醇混合液的吸光度Ac，以及待測液與等體積無水乙醇混合液的吸光度Aj。按照式1計算清除率。

式中:Ac為未加待測液時DPPH溶液的吸光度;Ai為加待測液時DPPH溶液的吸光度;Aj為待測液與無水乙醇混合液的吸光度;測定波長為517nm。

1.2.4 蛋白酶水解小麥面筋蛋白 準確稱取定量干燥小麥面筋蛋白，加入去離子水溶解;將蛋白溶液調(diào)節(jié)至指定pH，分別加入木瓜蛋白酶后恒溫水浴反應。反應結(jié)束后100℃滅酶活性;測定反應液最終pH，將酶解液在3000r/min離心15min，取上清液，冷藏待測。

1.2.5 正交實驗 酶促水解受諸多因素影響，出于對實驗的綜合考慮及單因素的實驗結(jié)果，以DPPH自由基清除率為考察指標，選取酶解溫度、酶解時間、加酶量、底物量四項作為考察因素，各取三個水平，進行L9(34)正交設計實驗，確定木瓜蛋白酶水解小麥面筋蛋白的最佳工藝條件，并對最優(yōu)條件進行驗證實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料組成分析

對原料基本組成進行分析，具體結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factor and levels of experiment

表2 谷朊粉基本化學組成Table 2 Basic chemical composition of wheat gluten

從表2測定結(jié)果可看出，谷朊粉的蛋白質(zhì)含量相當高，且營養(yǎng)豐富、價格低廉，是制備抗氧化肽的優(yōu)良蛋白來源。

2.2 木瓜蛋白酶酶解谷朊粉單因素實驗

2.2.1 酶解溫度對DPPH·清除率和多肽含量的影響選擇底物量5g，酶解時間4h，加酶100U/g，酶解溫度分別為 20、30、40、50、60、70、80℃，考察酶解溫度對制備谷朊粉蛋白酶解液抗氧化活性肽的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶解溫度對DPPH·清除率和多肽含量的影響Fig.1 Effect of temperature on DPPH radical scavenging and peptide content

由圖1可看出:溫度在20～40℃間，隨著酶解溫度的升高，越來越接近酶的最適溫度，由于溫度直接影響酶的活性及結(jié)構(gòu)，酶的活性逐漸增強，對谷朊粉的作用能力也逐漸增強，因此，DPPH自由基清除率及多肽含量增長迅速。40℃時，DPPH自由基清除率達到最高，為90.32%，表明，此時達到酶的最適溫度，酶的作用活性最強，對谷朊粉的作用強度最大。當酶解溫度超過40℃時，酶解液的DPPH·清除率開始下降，溫度超50℃時，多肽含量也開始下降，表明溫度過高可能已導致酶活性降低。因此，酶解溫度選擇為 40℃較為合適，在此條件下清除率達到90.32%，多肽含量為36.43mg/mL。

2.2.2 酶解時間對DPPH·清除率和多肽含量的影響 固定酶解溫度為40℃，加酶量125U/g，底物含量5g，分別酶解 1、2、3、4、5、6h，考察酶解時間對谷朊粉酶解液抗氧化能力的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶解時間對DPPH·清除率和多肽含量的影響Fig.2 Effect of time on DPPH redical scavenging and peptide content

由圖2可知，酶解1、2h時，谷朊粉酶解液的抗氧化能力顯著提高，在2～4h時增加趨于平緩，4h時DPPH·清除率達到最大值為95.25%。4～6h時，抗氧化能力開始下降。而酶解1～6h時，多肽含量一直增加。這表明:1～2h時蛋白酶與底物充分作用，所以反應迅速。2～4h時，酶與底物接觸的作用位點已滿，從而反應緩慢，4～6h時，由于時間過長，酶解液中的抗氧化活性肽與空氣接觸，被空氣中的氧氣氧化，從而又會引起產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的變化進而使清除率下降?？梢姡附鈺r間延長雖利于多肽含量增加，但其抗氧化活性4h后開始降低。因此，選擇酶解時間為4h。

2.2.3 加酶量對 DPPH·清除率和多肽含量的影響 固定溫度為40℃、底物含量5g，時間為4h，加酶量為25、50、75、100、125、150U/g，考察酶解時加酶量對谷朊粉酶解液抗氧化能力的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 加酶量對DPPH·清除率和多肽含量的影響Fig.3 Effect of enzyme on DPPH radical scavenging and peptide content

由圖3可知，隨著加酶量的增加，DPPH·清除率和多肽含量逐漸增加，當加酶量達到100U/g時，DPPH·清除率增加緩慢，多肽含量增加迅速。在加酶量達到125U/g時，DPPH自由基清除率最高，為95.58%。之后隨著加酶量的提高，谷朊粉酶解物的多肽含量繼續(xù)增加，DPPH自由基清除率開始下降，考慮可能是因為增加酶用量使得蛋白水解得更為充分，因此總多肽含量增加，但具有抗氧化活性的多肽量降低，導致DPPH自由基清除率下降。因此，選定加酶量為125U/g。

2.2.4 底物濃度對DPPH·清除率和多肽含量的影響固定酶解時間4h，酶解溫度40℃，加酶量125U/g，底物量分別為 1、2、3、4、5、6g，考察不同底物量的酶解產(chǎn)物的對DPPH自由基清除率的影響如圖4所示。

圖4 底物量對DPPH·清除率和多肽含量的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on DPPH radical scavenging and peptide content

由圖4可知，當?shù)孜锖窟_到5g時，DPPH自由基清除率基本達到最高，為95.88%;當?shù)孜锪啃∮?g時，清除率升高顯著，表明較低底物量不足以與酶完全反應;當繼續(xù)增大底物量時，酶解液羥DPPH·清除率呈現(xiàn)降低的趨勢。同時隨著底物濃度的增大，多肽含量逐漸增大，當?shù)孜锪窟_到5g后，其增加趨勢逐漸趨于平緩可能是由于當?shù)孜餄舛冗_到一定程度時，幾乎所有的酶分子都與底物結(jié)合，出現(xiàn)“飽和”現(xiàn)象，再增加底物濃度不利于水解，而且還有一定程度的抑制作用。由分析可知:在固定溫度40℃、酶解時間4h，加酶量125U/g條件下，當谷朊粉量為5g時，酶解液的DPPH·自由基清除率最高。

2.5 正交實驗方差分析結(jié)果

根據(jù)實驗結(jié)果，獲得實驗直觀分析表見表3。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

根據(jù)極差分析結(jié)果可知，各因素對小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響程度由高到低依次為:A＞C＞B＞D，即酶解溫度＞加酶量＞酶解時間＞底物量，最優(yōu)組合為A1B3C3D1，此組合未出現(xiàn)在正交表中。按此優(yōu)化條件下，DPPH自由基清除率達到96.59%，多肽含量為35.51mg/mL。各因素對小麥面筋蛋白酶解產(chǎn)物多肽含量的影響程度由高到低依次為:A＞D＞C＞B，即酶解溫度＞底物量＞加酶量＞酶解時間，最優(yōu)組合為A1B3C3D3，與正交表中第三組實驗一致，此最佳條件下，DPPH自由基清除率達到95.58%，多肽含量為36.43mg/mL?？梢钥闯觯瑑山M的最佳溫度(40℃)、加酶量(125U/g)及水解時間(4h)都相同，只是底物量有所區(qū)別?？紤]可能因為隨著底物濃度增加，酶分子都與底物結(jié)合出現(xiàn)“飽和”，同時，高濃度的底物反而抑制了抗氧化活性的表達。根據(jù)標準偏差值，可看出不同實驗組合對DPPH自由基清除率影響較大。本實驗主要是研究優(yōu)化抗氧化肽活性肽的制備工藝，同時考慮到經(jīng)濟效益，最終確定最佳組合為A1B3C3D1，即最佳的酶解工藝條件為:溫度40℃，底物量3.0g，水解時間4h，加酶量125U/g。

表3 正交實驗結(jié)果Table 3 The orthogonal experiment results

2.6 驗證實驗

采用溫度40℃，底物量3.0g，水解時間4h，加酶量125U/g的酶解條件與正交實驗中較優(yōu)組進行比較驗證，結(jié)果見表5。

表5 驗證實驗結(jié)果Table 5 Results of the proven experiment

即最佳的酶解工藝條件為:溫度40℃，底物量3.0g，水解時間4h，加酶量125U/g。在此工藝條件下，DPPH自由基清除率達到96.59%，多肽含量為35.51mg/mL。

3 結(jié)論

3.1 在木瓜蛋白酶酶解谷朊粉制備抗氧化多肽工藝研究中，通過正交實驗得出，對DPPH自由基清除率影響最大的因素是酶解溫度，其次是加酶量及酶解時間，底物濃度影響最小，酶解溫度及時間(F值＞F臨界值)具有顯著性。對多肽含量影響最大的因素是酶解溫度，其次是底物量及加酶量，酶解時間影響最小，酶解溫度(F值＞F臨界值)具有顯著性。

3.2 通過正交設計實驗確定木瓜蛋白酶的最適反應條件為:溫度40℃，底物量3.0g，水解時間4h，加酶量125U/g。在此工藝條件下，結(jié)合驗證實驗結(jié)果，DPPH自由基清除率可達96.59%，多肽含量為35.51mg/mL。說明木瓜蛋白酶酶解小麥面筋蛋白的酶解產(chǎn)物具有較強的抗氧化活性。

3.3 利用木瓜蛋白酶對谷朊粉進行酶解制備抗氧化多肽，對于多肽的組成和結(jié)構(gòu)有待進一步研究。

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