大鼠急性腸缺血模型中血清腸脂肪酸結(jié)合蛋白和D-乳酸濃度與缺血時間和腸組織損傷的相關(guān)性

石 卉, 吳本儼, 王昌正, 王衛(wèi)華, 劉文徽

（解放軍總醫(yī)院南樓臨床部消化內(nèi)科, 北京 100853）

急性腸缺血（acute mesenteric ischemia，AMI）時由于急性的腸壁動脈血供不足或靜脈回流障礙，從而引起腸壁的營養(yǎng)障礙或運動障礙，其主要并發(fā)癥為腸管節(jié)段性壞死[1]。該病起病急驟，早期癥狀、體征不典型，誤診率及病死率較高，尚缺少特異性生物標志物[2]，當出現(xiàn)明顯的腹膜炎體征以及特異性影像學表現(xiàn)時，病情往往已經(jīng)進入晚期，其臨床表現(xiàn)為腸管壞死、中毒性休克、多器官功能衰竭等，嚴重危及患者生命。盡管其在診斷技術(shù)和治療方法已有一些進展，但急性腸缺血的死亡率仍高達60%～80%[2]，誤診率達80%～95%[3]。本研究旨在探索大鼠急性腸缺血模型血清腸脂肪酸結(jié)合蛋白（intestinal fatty acid binding protein，I-FABP）和D-乳酸（D-lactate，D-Lac）濃度與缺血時間、腸黏膜損傷的相關(guān)性，以期為急性腸缺血早期血清標志物提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

抗I-FABP單克隆抗體（Sigma公司，美國），D-Lac測定試劑盒（嘉美生物，中國），ELISA免疫試劑盒（Cayman chemical，美國），酶標儀（DENLEY DRAGON Wellscan MK 3，芬蘭），分析軟件（Ascent software for Multiskan），離心機（TGL-168）。

1.2 實驗動物和分組

健康成年雄性Wistar大鼠60只（250～300g），購于解放軍總醫(yī)院動物實驗中心。標準飼料飼養(yǎng)，大鼠自由攝食和飲水。在進行實驗前，大鼠最少飼養(yǎng)1周以適應實驗室環(huán)境。采用隨機數(shù)字表法，將大鼠隨機分為6組：假手術(shù)組（空白對照）、缺血30min組、缺血60min組、缺血90min組、缺血120min組、缺血150min組，每組10只。

1.3 動物造模

手術(shù)前實驗動物禁食24h，自由飲水。手術(shù)當日，大鼠稱重后，10%水合氯醛（5mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉成功后，大鼠取背臥位固定于解剖墊，腹部手術(shù)區(qū)備皮，碘伏消毒。取腹部正中切口，長3～4cm，逐層剪開腹壁各層進入腹腔。將小腸向左側(cè)外置于溫生理鹽水浸濕的無菌紗布墊上，顯露腸系膜前動脈，在其主動脈起源處向遠端鈍性分離出1～2cm，靠近其根部用一個無創(chuàng)性微血管夾夾閉腸系膜前動脈，阻斷血流，觀察腸系膜區(qū)無血管搏動，腸色澤變蒼白，腸蠕動消失從而確認腸缺血誘導完成。假手術(shù)組僅開腹，顯露腸系膜前動脈，不進行缺血處理。之后，將外置的小腸還納腹腔，用兩把小血管鉗夾閉腹膜暫時關(guān)腹。同時右側(cè)股靜脈插管至下腔靜脈，用于持續(xù)輸液[生理鹽水5ml/（kg·h）]。根據(jù)分組既定時間，打開腹腔，經(jīng)腹主動脈抽血7～10ml，截取自幽門向下小腸組織約15cm，按上、中、下各5cm分瓶放入10%中性緩沖福爾馬林溶液固定，大鼠開放性氣胸致死，手術(shù)完畢。實驗期間，用加熱燈照射手術(shù)區(qū)以維持大鼠體溫恒定，所有大鼠腸系膜前動脈阻斷后給予生理鹽水50ml/kg皮下注射以擴容抗休克，手術(shù)操作遵循無菌術(shù)原則。

1.4 實驗標本預處理

1.4.1 血清標本制備及測定 各組動物實驗終點，通過腹主動脈穿刺采集全血樣本7～10ml，采血時注意防止溶血。37℃靜置20min使血液凝固，低溫離心機4℃ 2000轉(zhuǎn)/min離心20min分離血清，取上清液3～5ml于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ罁?jù)ELISA試劑盒說明書測定標本中I-FABP和D-Lac的濃度。

1.4.2 腸組織標本損傷評分 各組實驗終點，動物處死前，截取自幽門向下小腸組織約15cm，按上、中、下各5cm分段，迅速用冷生理鹽水溶液沖洗，清除黏液、污物等腸腔內(nèi)容物后，立即分瓶置入10%中性緩沖福爾馬林溶液，固定后石蠟包埋。依據(jù)Park/Chiu腸組織損傷評級系統(tǒng)，進行半定量的腸組織病理學評級。采用Kurt等[4]的評分系統(tǒng)：0級，正常組織黏膜；1級，上皮表面受損，腸絨毛尖端上皮下間隙輕度增大；2級，黏膜局灶潰瘍，上皮層從固有層消失或上皮下間隙增大程度中等以上；3級，局灶透壁性潰瘍，部分絨毛消失或大量上皮層消失；4級，大面積透壁性潰瘍，大量絨毛消失，毛細血管暴露擴張；5級，大面積透壁性潰瘍、出血，固有層中斷。

1.5 統(tǒng)計學處理

所用統(tǒng)計學描述和分析均在SPSS17.0統(tǒng)計包上進行。計量資料以±s表示。生化指標分析采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）及Student-Newman-Keuls post-hoc analysis評價各分組之間的差異。對于組織病理學評級，組間差異的比較采用Kruscal-Wallis檢驗及Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各缺血時間組血清I-FABP和D-Lac濃度測定

各組血清I-FABP和D-Lac濃度的變化如表1所示。缺血30min時血清I-FABP濃度即開始升高，缺血90min血清I-FABP濃度達到峰值（P＜0.05），其后隨著缺血時間的延長，I-FABP濃度逐漸下降。缺血60min時D-Lac開始升高，隨缺血時間延長，D-Lac濃度升高越明顯（P＜0.05）。

表1 各組血清I-FABP和D-Lac濃度的變化Table 1 Serum I-FABP and D-Lac concentration in rats of each group (n＝10,±s)

表1 各組血清I-FABP和D-Lac濃度的變化Table 1 Serum I-FABP and D-Lac concentration in rats of each group (n＝10,±s)

I-FABP: intestinal fatty acid binding protein; D-Lac: D-lactate.Compared with sham-operation group, *P＜0.05

Group D-Lac(ng/L) I-FABP(mg/L)Sham-operation group 0.72±0.18 22.62±5.33 Mesenteric ischemia group 30min 0.97±0.15 713.28±68.43*60min 1.53±0.16* 1227.61±197.28*90min 2.76±0.35* 1741.37±184.12*120min 3.62±0.31* 1372.17±151.71*150min 5.81±0.28* 1096.74±163.82*

2.2 I-FABP 免疫組化結(jié)果

經(jīng)I-FABP抗體以及DAB染色后，正常小鼠腸黏膜鏡下染色陽性率為9.2%，缺血90min組，鏡下染色陽性總個數(shù)、陽性總面積以及陽性率均為最高（平均72.5%；圖1），缺血120min組鏡下陽性率平均61.2%，缺血150min組鏡下陽性率平均值為44.8%。

圖1 缺血90min時I-FABP染色結(jié)果(陽性率最高達72.5%)Figure 1 Immunohistochemical staining of I-FABP at 90min with positivity rate of 72.5% (DAB ×400)

2.3 小腸黏膜損傷評分統(tǒng)計

假手術(shù)組小腸壁柔軟溫暖，系膜動脈搏動有力，色澤正常，蠕動均勻，約8次/min。其余各組缺血早期，可觀察到小腸、盲腸和部分結(jié)腸色澤蒼白，腸管痙攣變細，蠕動明顯增快，約12次/min。隨著缺血時間延長，缺血150min時，腸管無蠕動，腸壁顏色發(fā)黑，溫度明顯降低，但未見腸管穿孔。具體評分如表2所示。結(jié)果提示缺血時間越長，組織損傷評分越高。

表2 各組小腸黏膜損傷評分Table 2 Histopathological scores of intestinal mucosa in different groups (n)

2.4 I-FABP和D-Lac與小腸黏膜組織損傷相關(guān)性分析

Spearman等級相關(guān)非參數(shù)檢驗結(jié)果表明，血清D-Lac濃度與組織損傷正相關(guān)（r＝1）；血清I-FABP濃度與組織損傷評分無相關(guān)性（r＝0.6）。

3 討 論

I-FABP屬于細胞質(zhì)脂肪酸結(jié)合蛋白家族成員，富含于腸黏膜上皮絨毛中，正常情況下，周圍血管中I-FABP含量很低，但當遭受炎癥、缺氧、缺血及再灌注損害時，腸上皮細胞通透性增加，I-FABP釋出，通過毛細血管及毛細淋巴管進入血循環(huán)，可在周圍血中檢測出[5]。I-FABP具有如下特點[6]：（1）是存在于胞質(zhì)中的可溶性蛋白；（2）具有較高組織特異性；（3）組織含量豐富；（4）分子量低，易于檢測。有研究表明：由于I-FABP更多的位于絨毛的頂端，在缺血早期能比肝脂肪酸結(jié)合蛋白（liver fatty acid banding protein，L-FABP）更早釋放入血達到有效濃度[7]。趙海東等[8]用大鼠制作腸缺血模型，測定血清中的I-FABP含量，并與乳酸脫氫酶和肌酸激酶同工酶含量進行比較，發(fā)現(xiàn)腸缺血45min后血清I-FABP含量最高。劉牧林等[9]應用大鼠缺血再灌注模型，分別于腸缺血15min、腸缺血45min、腸缺血45min再灌注2h、腸缺血45min再灌注6h測定I-FABP濃度，發(fā)現(xiàn)缺血45min時I-FABP達峰值，而且I-FABP濃度與腸組織損傷程度正相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，I-FABP在腸缺血30min即明顯升高，90min達到峰值，而后隨著缺血時間的延長，其水平下降。I-FABP濃度與組織損傷程度無相關(guān)性，但是在缺血早期，即缺血90min內(nèi)，I-FABP與組織損傷程度正相關(guān)。病變腸組織免疫組化也顯示：缺血90min組鏡下染色陽性總個數(shù)、陽性總面積以及陽性率均為最高（68.3%～76.4%），進一步驗證了此時被破壞的腸黏膜組織釋放的I-FABP總量最高。本研究采用結(jié)扎大鼠腸系膜前動脈的方式造模，發(fā)現(xiàn)在持續(xù)腸缺血的情況下，血清I-FABP的濃度與腸組織損傷無相關(guān)性。考慮血清I-FABP濃度下降系由于缺血中后期富含I-FABP的腸黏膜絨毛組織破壞殆盡所致，提示當I-FABP水平下降時，缺血損害已侵及腸黏膜肌層。

D-Lac是腸道內(nèi)細菌的主要酵解產(chǎn)物之一，腸道菌群中多種細菌都可以產(chǎn)生，發(fā)生腸缺血時，正常腸黏膜屏障被破壞，導致其通透性增加，致使血清D-Lac濃度升高[10]。D-Lac具有以下特點[11]：（1）腸道通透性發(fā)生改變時即可引起血中D-Lac的濃度變化；（2）人體內(nèi)自身不產(chǎn)生D-Lac，且無D-Lac的代謝酶類，濃度相對穩(wěn)定；（3）D-Lac為腸道內(nèi)細菌代謝產(chǎn)物，其濃度改變具有較強的特異性。在本研究中，D-Lac水平在腸缺血早期升高不明顯，自缺血60min開始明顯升高，隨著腸缺血時間的延長而持續(xù)明顯升高，D-Lac與組織損傷具有明顯相關(guān)性，提示D-Lac可作為判定腸黏膜損傷的指標。但在腸缺血早期，D-Lac濃度變化不明顯。

綜上所述，I-FABP在缺血90min內(nèi)與腸組織損傷正相關(guān)，診斷敏感性較高，血清D-Lac在缺血60min后與腸組織損傷正相關(guān)。兩種指標均能準確反應腸黏膜損傷，如果I-FABP升高，而D-Lac正常，說明腸黏膜受到損傷，但腸黏膜屏障尚完整；如果I-FABP和D-Lac同時升高，說明腸黏膜屏障可能已經(jīng)受到破壞。因此，可考慮聯(lián)合采用這兩種指標，建立診斷模型用于急性腸缺血的早期診斷。

[1]中華醫(yī)學會老年醫(yī)學分會.老年人缺血性腸病診治中國專家建議[J].中華老年醫(yī)學雜志, 2011, 30(1): 1?6.

[2]Oldenburg WA, Lau LL, Rodenberg TJ，et al.Acute mesenteric ischaemia: a clinical review[J].Arch Intern Med, 2004, 164(10): 1054?1062.

[3]Brandt LJ, Boley SJ.AGA technical review on intestinal ischemia[J].Gastroenterology, 2000, 118(9): 954?968.

[4]Kurt Y, Akin ML, Demirbas S,et al.D-dimer in the early diagnosis of acute mesenteric ischemia secondary to arterial occlusion in rats[J].Eur Surg Res, 2005, 37(4):216?219.

[5]Pelsers MM, Hermens WT, Glatz JF.Fatty acid binding proteins as plasma markers of tissue injury[J].Clin Chim Acta, 2005, 352(1?2): 15?35.

[6]石 卉, 吳本儼.腸脂肪酸結(jié)合蛋白在缺血性腸病中的研究進展[J].中華老年多器官疾病雜志, 2011, 10(6):556?559.

[7]Kanda T, Tsukahara A, Ueki K,et al.Diagnosis of ischemic small bowel disease by measurement of serum intestinal fatty acid-binding protein in patients with acute abdomen: a multicenter, observer-blinded validation study[J].J Gastroenterol, 2011, 46(4): 492?500.

[8]趙海東, 田曉峰, 郭 健, 等.腸型脂肪酸結(jié)合蛋白對腸缺血早期診斷的意義[J].中國普通外科雜志, 2004,13 (7): 513?516.

[9]劉牧林, 張 嘉.腸脂肪酸結(jié)合蛋白和D-乳酸早期診斷腸缺血-再灌注損害的實驗研究[J].中華創(chuàng)傷雜志,2006, 22(10): 767?770.

[10]Evennett NJ, Petrov MS, Mittal A,et al.Systematic review and pooled estimates for the diagnostic accuracy of serological markers for intestinal ischemia[J].World J Surg, 2009, 33(7): 1374?1383.

[11]Block T, Nilsson TK, Bjorck M,et al.Diagnostic accuracy of plasma biomarkers for intestinal ischaemia[J].Scand J Clin Lab Invest, 2008, 68(3): 242?248.