斑馬魚CFL基因的克隆、多克隆抗體的制備及分析

王盼盼,彭夕洋,易 珍,江志剛,鄧 云,吳秀山,萬永奇

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斑馬魚CFL基因的克隆、多克隆抗體的制備及分析

王盼盼,彭夕洋,易 珍,江志剛,鄧 云,吳秀山,萬永奇*

(湖南師范大學(xué) 蛋白質(zhì)化學(xué)及魚類發(fā)育生物學(xué)教育部重點實驗室 心臟發(fā)育研究中心, 湖南 長沙, 410081)

在心臟發(fā)育過程中,相關(guān)基因的正常表達(dá)是有功能心臟形成的關(guān)鍵.斑馬魚CFL基因是從斑馬魚胚胎的cDNA文庫中克隆出來的一個心臟發(fā)育候選基因. 生物信息學(xué)分析表明: CFL基因編碼278個氨基酸, 含有一個CXXC結(jié)構(gòu)域. 為進(jìn)一步研究該基因的功能, 采用生物信息學(xué)結(jié)合RT-PCR的方法獲得了該基因. 將所得片段插入原核表達(dá)載體pET-28a載體中, 經(jīng)測序鑒定正確后轉(zhuǎn)化入Rosetta菌株中, 用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出pET- 28a-CFL融合蛋白, 表達(dá)的融合蛋白占菌體總蛋白的71%, 融合蛋白相對分子質(zhì)量約為30 kD. 經(jīng)包涵體純化后, 免疫新西蘭大白兔制備了多克隆抗體. 經(jīng)驗證, 具有較好的特異性和較高的效價, 可以用作western-blot免疫印跡等實驗分析.

CFL基因; 融合蛋白; 多克隆抗體

隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展和醫(yī)學(xué)知識的普及, 人類健康狀況發(fā)生了顯著改善, 平均壽命得到延長. 在工業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū), 常見的致殘或者致死的疾病曾經(jīng)是以傳染病及營養(yǎng)缺乏疾病為主, 目前卻逐步向慢性疾病轉(zhuǎn)變, 比如心血管疾病和腫瘤等. 據(jù)世界衛(wèi)生組織的資料, 全球近1/3的死亡人數(shù)是由心血管疾病所致, 心血管疾病是中低收入國家面臨的一個重大問題. 并且越來越多的人正在受到高血壓和糖尿病等病癥的威脅[1]. 在我國, 心血管疾病的發(fā)病率和死亡率一直呈持續(xù)上升趨勢, 估計全國心血管病患者達(dá)2.3億人, 而我國每年死于心血管病的人數(shù)約300萬, 幾乎每死亡3個人中就有1人是心血管病, 平均每小時心血管病死亡340人[2]. 更令人不安的是, 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計, 到2020年, 我國每年因心血管疾病死亡的人數(shù)將可能達(dá)到400萬. 然而隨著新診斷技術(shù)的不斷出現(xiàn)以及分子生物學(xué)的發(fā)展, 對一些心血管病的病因及發(fā)病機(jī)制在基因和蛋白質(zhì)組學(xué)的水平上有了新的認(rèn)識, 其對心臟病的治療前景將會有很大改觀.

脊椎動物的心臟由側(cè)板中胚層中的臟壁中胚層與鄰近組織相互作用發(fā)育而成, 脊椎動物心臟發(fā)育的過程異常復(fù)雜[3-4]. 心血管系統(tǒng)在諸多生理系統(tǒng)中, 是第一個行使功能的系統(tǒng), 其它各器官的發(fā)育和生長都要依靠心血管系統(tǒng)運輸營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣, 以及各種遠(yuǎn)距離調(diào)節(jié)信號, 內(nèi)分泌調(diào)控信號和代謝物[5].

斑馬魚CFL基因是本實驗室克隆的一個新的與心臟發(fā)育相關(guān)的基因, 含有CXXC鋅指結(jié)構(gòu)域, 其生物學(xué)功能未知. 但是經(jīng)過生物信息學(xué)分析得知, CFL的啟動子區(qū)域含有與心臟發(fā)育相關(guān)的Nkx2.5、ISL-1、AP-1等標(biāo)志基因的結(jié)合位點, 這為研究CFL在斑馬魚心臟發(fā)育中的作用提供了理論基礎(chǔ).

斑馬魚為新發(fā)現(xiàn)的基因的功能鑒定提供了一個幾乎理想的動物模型[5—6]. 本實驗以斑馬魚為模式生物, 以斑馬魚cDNA文庫為模板克隆了CFL基因, 并對其序列進(jìn)行BLAST比對, 用生物信息學(xué)軟件對其編碼蛋白的理化參數(shù)、二級結(jié)構(gòu)、抗原表位等進(jìn)行分析和預(yù)測, 制備了CFL全長的抗體, 為CFL在心臟發(fā)育中的相關(guān)功能研究奠定了基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

斑馬魚由本實驗室飼養(yǎng), 大腸桿菌E.coli TOP10和E.coli Rosetta菌株由本實驗室保存; 限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I及Taq DNA聚合酶購自深圳晶美公司; pMD18-T載體、pET-28a載體、T4連接酶購自大連TaKaRa公司; 質(zhì)粒提取試劑盒(離心柱型)購自O(shè)MEGA公司; 新西蘭大白兔購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院實驗動物中心.

1.2 方法

1.2.1 CFL基因的生物信息學(xué)分析及克隆

根據(jù) NCBI 基因庫中CFL編碼區(qū)序列以及原核表達(dá)載體pET-28a上的多克隆位點, 運用Primer5.0軟件設(shè)計了上下游特異性引物, Sense: 5'-GTCACCATCTTACC-3'(下劃線處為XhoI 酶切位點); Antisense: 5'-CCATGTCTGCCAGC-3'(下劃線處為EcoRⅠ酶切位點). 引物由上海生物公司合成. 以野生型斑馬魚的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 具體反應(yīng)條件如下: 95 ℃ 5 min, 94 ℃ 1 min, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 共28次循環(huán); 72 ℃延伸5 min. 所得PCR產(chǎn)物約為837 bp, 酶切純化后插入pMD-18T載體中, 通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞, 挑取陽性單克隆, 轉(zhuǎn)種搖菌后提質(zhì)粒. 重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和 EcoRⅠ雙酶切驗證正確后, 由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序鑒定.

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將測序正確的CFL目的片段連入帶有XhoⅠ和 EcoRⅠ酶切位點線性化的pET-28a載體, 轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中, 挑取陽性單克隆, 轉(zhuǎn)種搖菌后提質(zhì)粒，用XhoⅠ和 EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切檢測.

1.2.3 融合蛋白的表達(dá)和純化

將酶切正確的pET-28a-CFL轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta菌株, 菌落PCR驗證轉(zhuǎn)化成功之后, 在含100 mg/L 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)過夜. 然后按1%轉(zhuǎn)種并在37 ℃培養(yǎng)至OD 600 nm = 0.5～0.6后加入IPTG 至最終濃度為0.1 mmol/L, 在28 ℃誘導(dǎo)6 h, 不加IPTG作為對照. 誘導(dǎo)結(jié)束后離心收集菌體, 用1/50培養(yǎng)基體積的緩沖液懸浮細(xì)菌, 經(jīng)超聲波破碎后, 于4 ℃以13 000 r/min離心20 min, 收集包涵體. 包涵體經(jīng)純化得到的蛋白質(zhì)進(jìn)一步通過SDS-PAGE 分離純化, 切膠回收CFL特異性的蛋白條帶. 再經(jīng)溶解、透析濃縮后用Bredford方法測定蛋白質(zhì)濃度, 用于抗體制備[7].

1.2.4 CFL多抗血清的制備

取飼養(yǎng)1周的新西蘭大白兔2只, 120 μg 融合蛋白作為抗原與弗氏完全佐劑(Sigma)按 1: 1(/)比例完全混合, 經(jīng)乳化后在背部進(jìn)行皮下多點注射. 以后每間隔14 d, 取120 μg 的抗原和弗氏不完全佐劑按1: 1(/)比例完全混合, 用同樣方法加強(qiáng)免疫3次. 第4次免疫7 d后心臟取血, 25 ℃靜置過夜, 次日以最大轉(zhuǎn)速離心取上清[7].

1.2.5 Western blotting 分析抗體特異性

將含pET-28a-CFL重組子的Rosetta菌株在LB培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng), 按1: 50 比例接種于200 mL新鮮培養(yǎng)基中, 用IPTG 在37 ℃條件下誘導(dǎo)5 h后, 收集細(xì)菌, PBS重懸, SDS-PAGE電泳分離. 將得到的CFL抗體分別按照1: 200、1: 500、1: 800、1: 1 000、1: 1 500及1: 2 000(/)的比例稀釋, 以His抗體作為對照, 采用Western blotting方法檢測抗體的特異性.

2 實驗結(jié)果

2.1 CFL基因的生物信息學(xué)分析

斑馬魚CFL基因位于第14號染色體上, 全基因在基因組上長達(dá)28.23 kb, 含兩個外顯子, 一個內(nèi)含子. 其mRNA為1 115 bp, 成熟肽編碼區(qū)含有837 bp, 該轉(zhuǎn)錄本編碼一個長為278個氨基酸的蛋白質(zhì), 蛋白相對分子質(zhì)量為29.186 kD. 從279 bp到1 115 bp為開放閱讀框, 其編碼的蛋白質(zhì)第218到259個氨基酸之間預(yù)測含有CXXC結(jié)構(gòu)域. 進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)分析軟件對其編碼的氨基酸進(jìn)行分析, 確定其氨基酸中含有CXXC鋅指結(jié)構(gòu)域(如圖1). 利用斑馬魚CFL基因序列在NCB I數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Homologene搜索, 發(fā)現(xiàn)在人類、小鼠、大鼠、猩猩、狗、原雞、果蠅中都存在斑馬魚CFL的同源基因.

圖1 CFL蛋白結(jié)構(gòu)圖.

2. 2 CFL基因的克隆及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增出CFL基因的全長(圖2A), 將純化回收后的目的片段連入pMD-18T載體中. 通過轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài), 用Xho I和EcoR I雙酶切pMD-18T-CFL重組質(zhì)粒, 篩選出陽性單克隆后進(jìn)行測序. 測序結(jié)果顯示, 所克隆的CFL基因與NCB I數(shù)據(jù)庫中報道的基因片段是一致的.

圖2 CFL克隆及pET-28a-CFL質(zhì)粒鑒定圖.

將從pMD-18T-CFL質(zhì)粒上切取下來的斑馬魚CFL基因片段插入到pET-28a載體中, 構(gòu)建成pET-28a-CFL質(zhì)粒, 質(zhì)粒以XhoI和EcoR I酶切產(chǎn)生與CFL基因大小一致的酶切片段(圖2B), 表明斑馬魚CFL基因已成功插入到pET-28a載體中.

圖3 His-CFL融合蛋白的表達(dá). M: 蛋白Marker; WT: pET-28a-CFL誘導(dǎo)前; IPTG:37 ℃誘導(dǎo).

2.3 CFL融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將pET-28a-CFL重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài), 以0.1 mmol/mL濃度的IPTG分別在17℃、25℃及37℃恒溫?fù)u床上進(jìn)行誘導(dǎo). SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示, 在誘導(dǎo)6 h后出現(xiàn)1條大小為37 kD的特異性條帶, 并且3個溫度的誘導(dǎo)條件下都可以誘導(dǎo)出目的蛋白. 然而在37 ℃時, 蛋白的誘導(dǎo)量最多(圖3).

同時研究發(fā)現(xiàn)在37 ℃時蛋白大量的表達(dá)在沉淀中. 然后用包涵體純化方法對沉淀中的蛋白進(jìn)行純化, 考馬斯亮蘭染色檢測分別用8 mol/L、4 mol/L和2 mol/L尿素洗脫后的蛋白, 發(fā)現(xiàn)8 mol/L和4 mol/L尿素洗脫后的上清的蛋白比較純, 但是濃度較低, 達(dá)不到注射的量. 而用2 mol/L尿素洗脫后, 雜蛋白去除的較干凈, 并且經(jīng)過檢測, 蛋白量大于5 mg/mL, 可以用作免疫(如圖4).

圖4 pET-28a-CFL蛋白誘導(dǎo)純化圖. M: 蛋白Marker; 1, 3, 5分別為: 8、4、2 mol/L尿素洗脫后的上清; 2, 4, 6分別為: 8、4、2 mol/L尿素洗脫后的沉淀.

圖5 Western blot 檢測抗體效價

2.4 CFL多克隆抗體Western blot檢測效價

用純化后的CFL蛋白作為抗原, 免疫已在本實驗室飼養(yǎng)1周的生命力旺盛的新西蘭大白兔. 3次加強(qiáng)免疫之后收獲血清, 得到兔抗斑馬魚CFL抗體, 稀釋6個濃度梯度作為一抗進(jìn)行效價檢測. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗體在稀釋濃度為1: 1 500(/)時仍然可以檢測到雜交信號(圖5).

2.5 CFL多克隆抗體特異性檢測

利用制備的CFL多克隆抗體分別對pET-28a空載體及重組子pET-28a-CFL兩種菌株經(jīng)IPTG所誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行Western blot檢測. 同時運用His抗體對上述兩種蛋白進(jìn)行Western blot檢測, 以作為對照實驗. 兩組實驗結(jié)果表明: 在His抗體檢測的這組中, 在pET-28a-CFL所誘導(dǎo)的37 kD處和pET-28a空載體所誘導(dǎo)的8 kD左右均有目的條帶出現(xiàn). 而在CFL抗體檢測的實驗組中, 則只在pET-28a-CFL菌株所誘導(dǎo)的37 kD處有目的條帶(圖6). 說明利用pET-28a-CFL融合蛋白制備的CFL多克隆抗體對CFL蛋白有抗性, 而對pET-28a載體所表達(dá)的His蛋白沒有抗性.

圖6 CFL抗體特異性檢測. 1:Myc-CFL融合蛋白;2:His蛋白空白對照.

3 討論

心臟形態(tài)發(fā)生包括細(xì)胞決定、遷移和分化, 且伴隨著一系列關(guān)鍵的形態(tài)發(fā)生事件. 在心臟發(fā)生的每個階段, 都有特異性的轉(zhuǎn)錄因子在起調(diào)控作用[5]. 其中一些轉(zhuǎn)錄因子中含有一個保守的CXXC(Cys- Xaa-Xaa-Cys)鋅指結(jié)構(gòu). 鋅指結(jié)構(gòu)(zinc finger)是蛋白質(zhì)與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)之間相互結(jié)合的一種方式, 結(jié)構(gòu)上相對保守, 能夠高度識別特異的DNA序列, 并且與DNA之間的作用相對簡單, 是由螺旋(或折疊)-環(huán)-螺旋(或折疊)所構(gòu)成的超二級結(jié)構(gòu), 以及絡(luò)合Zn離子所形成的空間構(gòu)象[5, 8].

目前, 國內(nèi)有關(guān)CXXC家族蛋白的研究正處于起步階段, 尚未見CFL蛋白的相關(guān)研究報道. 為了深入地研究斑馬魚CFL基因的功能, 需要獲得其純化的蛋白. 在制備CFL抗體時, 選用了CFL基因的全長所表達(dá)的蛋白作為免疫原, 從而降低了抗體的多效性. 另外, 本實驗選用了帶有His標(biāo)簽的pET-28a表達(dá)載體, 是因為與帶有GST標(biāo)簽的表達(dá)載體相比, His標(biāo)簽的序列較短, 對抗體特異性的影響較低. 采用了3個不同溫度、IPTG濃度及誘導(dǎo)時間來研究在哪種條件下蛋白更容易被誘導(dǎo)到上清中. 因為在誘導(dǎo)過程中, 蛋白極易以包涵體的形式表達(dá)在沉淀中, 不易純化. 由于本實驗所用的是CFL基因的全長作為抗原, 親水性和疏水性的選擇就受到了限制, 因此上清中的蛋白量非常少, 達(dá)不到注射濃度, 最終在包涵體中純化了抗原, 實驗還發(fā)現(xiàn)在包涵體洗滌時增加NaCl濃度到0.5 mol/L, 有助于包涵體中雜蛋白的溶解.

斑馬魚CFL鋅指蛋白的表達(dá)和純化是本研究的目的. CFL蛋白的理論值是29.186 kD, pET-28a表達(dá)載體上包含6個組氨酸的理論值是0.84 kD. 計算pET-28a-CFL的理論分子量約為30 kD. 然而在SDS-PAGE上電泳后, 發(fā)現(xiàn)其目的條帶在37 kD左右, 與理論值相差7 kD. 這可能是由于His-tag的強(qiáng)電荷作用, 這種強(qiáng)電荷作用可能是造成許多其他His-tag 融合蛋白在SDS-PAGE 中表觀分子量偏大的原因[9].

在用IPTG誘導(dǎo)抗原大量表達(dá)的時候, 可以通過結(jié)果部分圖3及圖4的誘導(dǎo)圖看出, 在72 kD左右也有被誘導(dǎo)出的新條帶, 但是濃度非常低, 猜測這是因為CFL蛋白被sumo化所導(dǎo)致的, 具體的原因需要相關(guān)的實驗進(jìn)一步證實. 另外, 兔子的飼養(yǎng)是實驗中比較關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié), 在免疫新西蘭大白兔時, 要首先確保兔子的身體狀況良好, 并且注意將抗原與弗氏佐劑完全混勻, 否則沒有溶解的包涵體會阻塞針管, 導(dǎo)致抗原不能完全注射進(jìn)去.

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Prokaryotic expression and purification of the zebrafish CFL gene and preparation of its polyclonal antibody

WANG Pan-pan, PENG Xi-yang,YI Zhen, JIANG Zhi-gang, DENG Yun, WU Xiu-shan, WAN Yong-qi

(The Center for Heart Development, Key Lab of MOE for Development Biology and Protein Chemistry, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

The normal expression of related genes is critical in the heart development process. To explore the heart development related genes, to provide the basis to understand the pathogenesis of congenital heart disease and interventional treatment. CFL gene is a candidate gene for heart development from Zebrafish cDNA library. Bioinformatics analysis revealed that it contains CXXC domain, and encoding 278 amino acids. To further investigate the possible functions of CFL in the process of heart development, the full length of CFL gene was cloned and inserted into pET-28a vector.The His-CFL fusion protein was induced by IPTG, the expression of fusion protein accounts for 71 of total bacteria protein.The relative molecular mass is about 30 kD. After inclusion body purification, immune the New Zealand white rabbit to prepared polyclonal antibody and was indentifited by western blot. These results demonstrate that the high titer polyclonal antibody was obtained.

CFL; fusion protein; polyclonal antibody

10.3969/j.issn.1672-6146.2013.04.006

Q 75

1672-6146(2013)04-0024-05

email: wanyongqi@aliyun.com.

2013-09-30

國家自然科學(xué)基金項目(30900851)

(責(zé)任編校:譚長貴)