海濱木巴戟組織培養(yǎng)研究

郭 佳，朱鵬飛，房 丹，高中海，徐 梁

（1. 浙江誠邦園林股份有限公司，浙江 杭州 310006；2. 海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司，海南 海口 570125；

3. 福建生生生物技術(shù)開發(fā)有限公司，福建 福州 350000；4. 國家林業(yè)局林產(chǎn)工業(yè)規(guī)劃設(shè)計院，北京 100010；5. 浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023）

海濱木巴戟組織培養(yǎng)研究

郭 佳1,2，朱鵬飛2，房 丹3，高中海4，徐 梁5*

（1. 浙江誠邦園林股份有限公司，浙江 杭州 310006；2. 海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司，海南 ?？?570125；

3. 福建生生生物技術(shù)開發(fā)有限公司，福建 福州 350000；4. 國家林業(yè)局林產(chǎn)工業(yè)規(guī)劃設(shè)計院，北京 100010；5. 浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023）

以海濱木巴戟（Morinda citrifolia）的嫩芽為外植體進行組培研究，以1/2MS+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L為基本培養(yǎng)基，以TDZ、BA、IBA三種激素進行不定芽的誘導(dǎo)分化實驗，以IBA、NAA進行生根實驗。結(jié)果表明，各因素對外植體分化的影響皆不顯著（p < 0.05），IBA抑制外植體分化；在只添加BA的培養(yǎng)基中，隨著BA濃度的升高，外植體玻璃化的現(xiàn)象有增加的趨勢；生根實驗結(jié)果表明，NAA和IBA誘導(dǎo)生根效果相差不大（p < 0.05），但是IBA在外植體基部誘導(dǎo)出更多的愈傷組織。

海濱木巴戟；組培；分化；生根

海濱木巴戟（Morinda citrifolia）也稱海巴戟、海巴戟天，茜草科，屬熱帶濕地植物。分布于亞洲、澳洲和太平洋諸島，在中國僅分布于海南及西沙群島、臺灣島[1]。海濱木巴戟為常綠灌木或小喬木，兩性花，每顆果實內(nèi)有多達上百粒種子。在自然界中海濱木巴戟的發(fā)芽率極低，這可能跟種皮不透水的構(gòu)造有關(guān)[2]。波利尼西亞民間把海濱木巴戟應(yīng)用于醫(yī)藥已經(jīng)有2 000多年的歷史[3]，20世紀末，海濱木巴戟的經(jīng)濟價值逐漸得到開發(fā)，相關(guān)的研究也逐漸展開[4]。海濱木巴戟含有多種藥用成分，現(xiàn)代藥理實驗揭示海濱木巴戟有抗細菌、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤、抗寄生蟲、鎮(zhèn)痛、降血壓、消炎和提高免疫力的活性[5]。大溪地、庫克等國外品牌開發(fā)了海濱木巴戟的果汁飲料、膠囊、香皂等系列產(chǎn)品，且廣受歡迎。在我國，海濱木巴戟的研究與開發(fā)較晚，目前僅海南省幾家企業(yè)開展了海濱木巴戟的產(chǎn)品研發(fā)和推廣。

為了進行大面積商業(yè)種植開發(fā)，擺脫海濱木巴戟種子極低發(fā)芽率的限制，針對海濱木巴戟的育種開展了以下一些相關(guān)研究：直接扦插繁殖[1,6]，但成活率較低[1]；利用種子作為材料進行育種試驗，一部分對種子進行處理，直接進行發(fā)芽試驗[7~8]，另外一部分利用種子進行組織培養(yǎng)研究[2,9~10]，其中以海濱木巴戟定芽為外植體的試驗較少[11]，且未見用正交設(shè)計的方式進行研究[12~13]。本實驗為保持母本的優(yōu)良性狀，采取嫩芽為外植體進行海濱木巴戟組培研究。

1 材料與方法

1.1 材料

海濱木巴戟來源于海南。在久晴的天氣采集一年生健康植株的嫩枝，帶回實驗室消毒。

1.2 外植體消毒方法

修剪掉多余的枝葉后，將外植體用洗衣粉溶液浸泡15 ~ 20 min，流水沖洗1 h，在無菌環(huán)境下，用70%乙醇浸泡10 s，無菌水清洗1遍，再用0.1% HgCl2浸泡9 ~ 12 min，無菌水沖洗5遍。

1.3 基本培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基為1/2MS+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L，pH5.6 ~ 5.8。

1.4 不定芽的誘導(dǎo)分化

在基本培養(yǎng)基中，添加濃度梯度分別為0.5、1.0、1.5 mg/L的BA（6-芐氨基腺嘌呤），0.001、0.01、0.1 mg/L的TDZ（苯基噻二唑基脲）和0.05、0.1、0.2 mg/L的IBA（吲哚丁酸）3種激素，進行試驗設(shè)計。每個處理30個外植體，重復(fù)3次試驗。在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個月后，統(tǒng)計出芽情況。取3次實驗的均值，進行統(tǒng)計分析。

1.5 壯苗生根

在基本培養(yǎng)基中，采用IBA、NAA（萘乙酸）2種生長素進行的生根實驗，濃度梯度為0.1、0.3、0.6、0.9 mg/L。將分化苗接種到壯苗生根培養(yǎng)基中兩周后，觀察實驗結(jié)果并分析。

1.6 統(tǒng)計方法

芽增殖倍數(shù) = 不定芽數(shù)/接種莖段數(shù)

生根率 =（生根苗數(shù)量/接種外植體數(shù)）×100%

平均根數(shù) = 根系數(shù)量/接種外植體數(shù)

2 結(jié)果

2.1 分化實驗情況

1個月后，統(tǒng)計分化結(jié)果，按 L9（34）表進行數(shù)據(jù)處理，得到表1。

從表1中的各因素均值看，隨著BA、TDZ濃度升高，芽的增殖倍數(shù)也隨之增加；IBA則相反，隨其濃度升高芽增殖倍數(shù)逐漸降低，表明IBA不利于芽的增殖。

表1 三種激素對海濱木巴戟不定芽分化的影響Table 1 Effect of three hormones on bud differentiation

從表1中可看出，各因素極差值都很小，說明各激素對于不定芽的分化影響都沒有顯著差異。根據(jù)極差大小順序排出影響分化的因素的主次順序為IBA＞BA＞TDZ。該項實驗中的各因素較優(yōu)水平組合是IBA1+BA3+TDZ3，即IBA0.05 mg/L+BA0.5 mg/L +TDZ0.001 mg/L。

由表2可知，在實驗的濃度范圍內(nèi)，各種激素濃度水平間差異對芽增殖效果都達不到顯著水平。

按正交設(shè)計的結(jié)果，撤去生長素，將BA濃度設(shè)定在1.0mg/L，TDZ濃度設(shè)定在0.001、0.01、0.1 mg/L三個梯度，或TDZ濃度保持0.001mg/L不變，BA濃度梯度為0.5、1.0 、1.5mg/L，再進行分化試驗，進行2次重復(fù)。觀察在只添加兩種分裂素的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中外植體的表現(xiàn)，實驗結(jié)果如表3。

表2 三種激素對海濱木巴戟不定芽分化影響的方差分析Table 2 ANOVA of Effect of three hormones on bud differentiation

由表3可見，當TDZ濃度由0.001 mg/L升至0.0 1mg/L時，或當BA濃度由0.5 mg/L升至1.0 mg/L時，外植體的增殖倍數(shù)增加了，當TDZ濃度由0.01 mg/L升至0.1 mg/L時，或當BA濃度由1.0 mg/L升至1.5 mg/L時，外植體的增殖倍數(shù)反而隨之降低。在統(tǒng)計不定芽的過程中發(fā)現(xiàn)，在含TDZ 0.1 mg/L或BA 1.5 mg/L的培養(yǎng)基中，莖段、分化芽玻璃化和畸形苗的出現(xiàn)比率較高，這部分苗不計算在有效不定芽內(nèi)。

表3 誘導(dǎo)分化實驗Table 3 Differentiation experiments

在未添加任何激素的對照培養(yǎng)基中，無菌苗不進行分化，只進行伸長生長，部分同時有生根現(xiàn)象。說明外植體內(nèi)源生長素濃度水平較高。

2.2 壯苗生根

將分化苗接種到壯苗生根培養(yǎng)基中，1個月后統(tǒng)計生根情況，結(jié)果見表4。

由表4可知，當IBA濃度為0.1 ~ 0.3 mg/L，生根率最高，為100%，當IBA濃度為0.6mg/L時，平均生根數(shù)量最多，為8.3根；當NAA濃度為0.3～0.6mg/L時，生根率最高，為100%，當NAA濃度為0.3mg/L時，平均生根數(shù)量最多，為8.5根。

本試驗中，兩種生長素在外植體的生根數(shù)量上效果相差不大，但在根系的表現(xiàn)上則有較大區(qū)別。在添加IBA的生根培養(yǎng)基中，隨著IBA濃度的增加，無菌苗基部會誘導(dǎo)出很多的愈傷組織，在NAA中則出現(xiàn)少量或沒有愈傷，根系中的毛細根隨著NAA濃度的升高而增加。

表4 生根培養(yǎng)基及無菌苗生根情況Table 4 Effect of two hormones on rooting

2.3 煉苗

將組培苗移至大棚，1周之后，將生根苗從組培瓶中取出，清洗干凈根須上的培養(yǎng)基，用1000倍的百菌清溶液浸泡3 min，清水中浸泡片刻，再移植至已用5%高錳酸鉀消毒過的苗圃。移植初期，需要經(jīng)常進行噴霧，以保持葉片表面水分充足。10 d之內(nèi)需要進行遮陽，以免葉片水分過快蒸發(fā)，影響成活率。10 d之后視情況可以進行全日照培養(yǎng)，成活率80% ~ 90%。

3 結(jié)論與討論

黃騏[2]利用子葉和下胚軸作為試驗外植體，單獨使用BA即可誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生，添加NAA0.05 ~ 0.1mg/L則完全抑制不定芽發(fā)生，用NAA、IBA、IAA分別進行生根試驗，發(fā)現(xiàn)均有根群發(fā)生，但NAA0.1 mg/L誘導(dǎo)生根時切口愈傷組織較多，部分不定根由愈傷組織發(fā)生，而IAA0.1mg/L誘導(dǎo)生根時根系欠發(fā)達，以IBA0.1mg/L最佳，部分試驗結(jié)果與本實驗有類似的地方；韋麗君[9]以實生苗為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA1.5 mg/L和6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L為芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，添加6-BA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L為芽增殖培養(yǎng)基，1/2MS +NAA0.5 mg/L為生根培養(yǎng)基。芽的平均增殖系數(shù)約為5倍，30 d后生根率可達85%，每株的根數(shù)有4 ~ 6條；陳雄庭[11]選取幼嫩側(cè)枝，以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA2 mg/L+NAA0.1 mg/L為初代和繼代培養(yǎng)基，40 ~ 50 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)2 ~ 3倍，切取2 ~ 3 cm新芽接種至1/2MS+IBA0.1mg/L+活性炭1g/L+蔗糖30 g/L，生根率達到100%。

本研究用正交設(shè)計的方法進行誘導(dǎo)分化試驗，得到三因素較優(yōu)水平組合是IBA1+BA3+TDZ3，即IBA0.05 mg/L+BA0.5 mg/L+TDZ0.001 mg/L。在試驗的濃度范圍內(nèi)IBA、TDZ、BA對不定芽的分化皆沒有顯著影響，且IBA不利于不定芽分化。在單獨添加分裂素的培養(yǎng)基中，雖然TDZ、BA有利于外植體不定芽的分化，但是外植體不耐受高濃度的分裂素，濃度越高畸形苗的現(xiàn)象越嚴重。觀察發(fā)現(xiàn)，外植體頂端優(yōu)勢很明顯：在同一分化芽叢中，只有其中一兩個芽能伸長生長，其余叢芽必須分離后才能長成較大的植株。所以我們推測，IBA對于分化率的影響雖然是負面的，但是適當?shù)纳L素/分裂素比例，對保持外置體的正常分化和生長，有一定的促進作用。在一定程度上保證了分化苗的正常生長。在本次試驗中，海濱木巴戟的增殖倍數(shù)最高為4.8。在海濱木巴戟同類的育種研究文章中，同樣沒有獲得較高的增殖倍數(shù)。生根相對分化要容易很多。在未添加任何激素的培養(yǎng)基中，多數(shù)外植體也有少量生根現(xiàn)象，再次說明外植體內(nèi)源生長素濃度水平較高。在生根實驗中，我們將NAA和IBA進行了比較，誘導(dǎo)生根效果相差不大，但是觀測發(fā)現(xiàn)，IBA在外植體基部誘導(dǎo)出更多的愈傷組織。相對生根效果最好的是NAA0.3 mg/L，生根率為100%，平均生根數(shù)為8.5。

本實驗中海濱木巴戟的組培增殖率偏低，海濱木巴戟不同發(fā)育階段的材料對植物生長調(diào)節(jié)劑或營養(yǎng)成分的要求可能有較大差異，還需進一步的研究提高其快繁效率。

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Experiment on Tissue Culture of Morinda citrifolia

GUO Jia1，ZHU Peng-fei2，F(xiàn)ANG Dan3，GAO Zhong-hai4，XU Liang5*
（1. Zhejiang Chengbang Landscape Co. Ltd, Hangzhou 310006, China; 2. Hainan Noni Biological Engineering Development Co. Ltd, Haikou 570125, China; 3. Fujian Shengsheng Biotech Corporation, Fuzhou 350000, China; 4. Forest Product Industry Planning and Design Institute of The State Forestry Administration, Beijing 100010, China; 5. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China）

The axillary buds of Morinda citrifolia were used as the explants to establish the micro-propagation system. The orthogonal experiment of bud differentiation was carried out by TDZ, BA and IBA. The results showed that three hormones had no significant(p < 0.05) effect on bud differentiation, but IBA inhibited the differentiation. The number of vitrification shoots increased with the concentration of BA when the medium was only added BA. Experiment on rooting induction demonstrated that the influences of NAA and IBA had no obvious difference (p < 0.05). However, more callus were induced from the base of explant in the medium with IBA.

Morinda citrifolia; tissue culture; differentiation; rooting

S723.1+34

B

1001-3776（2013）05-0081-04

2013-05-14；

2013-07-12

浙江省花卉新品種選育重大科技專項重點項目（2012C12909-5）；浙江省重大科技專項重點農(nóng)業(yè)項目（2013F10020）

郭佳（1980-），女，浙江金華人，工程師，碩士，從事林木及觀賞植物遺傳育種研究。