不同基因型變異鏈球菌臨床分離株的分離和鑒定

王成龍　蘇東華　劉佼佼等

[摘要] 目的 分離鑒定變異鏈球菌臨床分離株。方法 收集高齲患者和無(wú)齲健康人口腔中牙菌斑標(biāo)本進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生物化學(xué)鑒定、自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)分析、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增變異鏈球菌基因的特異性片段表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ（spaP）、葡糖基轉(zhuǎn)移酶B（gtfB）和葡聚糖酶（dexA）以及基因分型等方法對(duì)獲得的變異鏈球菌臨床分離株進(jìn)行鑒定。結(jié)果 從32例臨床受試者口腔中分離獲得46株變異鏈球菌臨床分離株，經(jīng)生物化學(xué)，自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)，變異鏈球菌的特異性基因spaP、gtfB和dexA的PCR擴(kuò)增均鑒定為變異鏈球菌，基因分型發(fā)現(xiàn)其中5株臨床分離株的基因型與其他菌株相同。結(jié)論 獲得41株不同基因型變異鏈球菌臨床分離株。

[關(guān)鍵詞] 變異鏈球菌； 基因型； 分離； 鑒定

[中圖分類號(hào)] R 780.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.020 變異鏈球菌（Streptococcus mutans）是人類口腔中最主要的致齲菌[1]。變異鏈球菌群中各菌種的分離與

鑒定是進(jìn)行齲病研究的基礎(chǔ)。細(xì)菌菌種的鑒定方式經(jīng)歷了由傳統(tǒng)的表型、血清型方法到以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的基因型方法的轉(zhuǎn)變。本文采用形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)、擴(kuò)增變異鏈球菌基因的特異性片段區(qū)域以及基因分型等方法對(duì)獲得的變異鏈球菌臨床分離株進(jìn)行鑒定，為齲病臨床和基礎(chǔ)研究提供材料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

變異鏈球菌國(guó)際參考株Ingbritt（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所提供），金黃色葡萄球菌臨床分離株188號(hào)（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室提供）。

1.2 病例選擇

納入標(biāo)準(zhǔn)：高齲患者，齲失補(bǔ)牙（decayed-mis-sing-filled-tooth，DMFT）指數(shù)≥6；無(wú)齲健康人，

DMFT指數(shù)=0。排除標(biāo)準(zhǔn)：飲食結(jié)構(gòu)異常，有嗜甜

食（飲）及睡前進(jìn)餐等不良飲食習(xí)慣者；接受放療和化療的患者；舍格倫綜合征患者；嚴(yán)重全身系統(tǒng)性疾病者；近3個(gè)月內(nèi)服用抗生素者；接受正畸治療者；口腔衛(wèi)生狀況不良者；牙齒結(jié)構(gòu)異常者；涉及取樣的牙體有牙髓病變、根面暴露或根面齲、未控制的牙周病變、冠或固定橋等修復(fù)體者。

根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，從臨床初次就診的患者中選取受試者，受試者的取樣位點(diǎn)均為無(wú)齲損的釉質(zhì)光滑面。采集菌斑前，均向受試者及其陪同人員說明實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮瓦^程，取得同意并簽署知情同意書。

40例受試者參加實(shí)驗(yàn)，其中高齲患者26例（DMFT指數(shù)為7.40±2.07），無(wú)齲健康人14例。

1.3 菌斑采集與處理

受試者清水漱口，去除食物殘?jiān)?，棉卷隔濕并用無(wú)菌生理鹽水沖洗收集區(qū)，更換棉卷，隔濕，用無(wú)菌刮匙刮取釉質(zhì)光滑面菌斑后，立即將其置于預(yù)先消毒滅菌，盛有1 mL改良液體Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基，上覆液體石蠟的Eppendorf管中密封。標(biāo)本在2 h內(nèi)轉(zhuǎn)送至實(shí)驗(yàn)室。所取的菌斑樣本經(jīng)振蕩器混勻1 min后，用無(wú)菌生理鹽水做10倍系列稀釋。

1.4 變異鏈球菌的分離

1.4.1 細(xì)菌初代培養(yǎng) 取原液、10-1、10-2、10-3稀釋液各100 μL，接種于胰蛋白酶水解物-酵母提取物-半胱氨酸-蔗糖-桿菌肽瓊脂（tryptone-yeast extract-cysteine with sucrose and bacitracin agar，TYCSB）培養(yǎng)平板[2]內(nèi)，置于厭氧環(huán)境（體積分?jǐn)?shù)80%N2、10%H2、10%CO2）下37 ℃培養(yǎng)48 h，然后進(jìn)行菌落形態(tài)的觀察。

1.4.2 細(xì)菌次代純化培養(yǎng) 將經(jīng)初代培養(yǎng)的具有典型菌落形態(tài)的單個(gè)菌落接種于輕型唾液鏈球菌-桿菌肽瓊脂（mitis salivarius with bacitracin agar，MSB）

培養(yǎng)平板[2]內(nèi)，置于厭氧環(huán)境下37 ℃培養(yǎng)48 h，然后

進(jìn)行菌落形態(tài)的觀察及革蘭染色檢查。

1.5 變異鏈球菌臨床分離株的鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 純化培養(yǎng)的細(xì)菌經(jīng)革蘭染色，于油鏡（100×10）下觀察菌體染色、形狀和排列情況。

1.5.2 生化鑒定 用無(wú)菌接種環(huán)收集培養(yǎng)48 h的MSB培養(yǎng)平板表面的菌落（經(jīng)鏡下觀察證實(shí)為純化培養(yǎng)

物），混懸于1.0 mL的無(wú)菌生理鹽水中制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木患?xì)菌懸液。取待測(cè)細(xì)菌懸液分別滴入需要實(shí)驗(yàn)的盛有甘露醇、山梨醇、棉子糖、密二糖、七葉苷和精氨酸的安瓿瓶中，每瓶3滴，以進(jìn)行臨床分離株的糖酵解實(shí)驗(yàn)和水解實(shí)驗(yàn)，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。此外，將菌懸液滴加于清潔的載玻片上后，滴加體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫，觀察有無(wú)氣泡產(chǎn)生。以變異鏈球菌國(guó)際參考株Ingbritt為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌生理鹽水為陰性對(duì)照。

1.5.3 自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定 經(jīng)傳統(tǒng)生化鑒定確定為變異鏈球菌的臨床分離株，再分別用API 20 Strep鑒定條或VITEK 2全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)一步鑒定，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)方法參照儀器使用說明書進(jìn)行。API 20 Strep的結(jié)果分別于4 h和24 h讀??；VITEK 2全自動(dòng)微生物分析儀的測(cè)定結(jié)果于8 h內(nèi)讀取。經(jīng)上述鑒定方法證實(shí)為變異鏈球菌者，用體積比1∶1的甘油腦心浸液（brain-heart infusion，BHI）液體培養(yǎng)基保種，于-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 分子生物學(xué)鑒定 通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（poly-

merase chain reaction，PCR）方法擴(kuò)增變異鏈球菌基因的特異性片段區(qū)域，包括表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ（sur-face protein antigen Ⅰ/Ⅱ，spaP）基因[3]、葡糖基轉(zhuǎn)移酶B（glucosyltransferase B，gtfB）基因[4]和葡聚糖酶（dextranase，dexA）基因[5]，目的片段大小分別為192、517和1 272 bp。以變異鏈球菌國(guó)際參考株Ingbritt為陽(yáng)性對(duì)照，金黃色葡萄球菌臨床分離株188號(hào)為陰性對(duì)照。

引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank提供的基因序列并參考文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)spaP[3]、gtfB[4]和dexA[5]特異性引物（表1），由美國(guó)Invitrogen公司中國(guó)分公司合成。

細(xì)菌基因組DNA的提?。焊鶕?jù)參考文獻(xiàn)[3-5]提取細(xì)菌基因組DNA，用紫外分光光度儀進(jìn)行定量測(cè)定。

以基因組DNA為模板，通過合成的特異性引物，利用PCR的方法，從中釣取目的基因片段。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR反應(yīng)體系：10×Taq Buffer 5 μL，dNTP（每種核苷酸2.5 mmol·L-1）4 μL，上游引物

（25 pmol·μL-1）1 μL，下游引物（25 pmol·μL-1）1 μL，基因組DNA 1.5 μL，Taq DNA聚合酶（2 U·μL-1）

0.5 μL，加滅菌去離子水補(bǔ)齊至50 μL；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，共30個(gè)循環(huán)反應(yīng)。

1.5.5 基因分型鑒定[6] 使用OPA5引物[7]（5-AGG-GGTCTTG-3）以隨機(jī)引物PCR完成基因分型鑒定。

PCR反應(yīng)體系：5 μL 10×Taq Buffer，300 μmol·L-1 dNTP（每種核苷酸2.5 mmol·L-1），100 pmol引物，5 μL基因組DNA，5 U Taq DNA聚合酶，加滅菌去離子水補(bǔ)齊至50 μL；PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，36 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min，72 ℃ 5 min，共35個(gè)循環(huán)反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，Photo system EAGLE EYE Ⅱ（Stra-tagene公司，美國(guó)）記錄圖像，BioNumerics數(shù)據(jù)庫(kù)軟件進(jìn)行圖像處理，經(jīng)程序統(tǒng)一的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)，標(biāo)定條帶位置，必要時(shí)進(jìn)行手工校正。每?jī)蓚€(gè)圖像之間的相似性系數(shù)用Dice系數(shù)表示，相似性系數(shù)設(shè)定為95%。

2 結(jié)果

2.1 菌落檢測(cè)及細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定

菌落肉眼觀察結(jié)果：細(xì)菌初代培養(yǎng)時(shí)，TYCSB平板上的菌落為較小的白色菌落，邊界清楚（圖1A）；細(xì)菌次代純化培養(yǎng)時(shí)，MSB平板上的菌落為深藍(lán)色，嵌頓于培養(yǎng)基內(nèi)，質(zhì)硬，表面粗糙且突起，邊緣不齊，形成“霜玻璃”樣外形（圖1B）。經(jīng)革蘭染色，

鏡下觀察可見，菌落為革蘭陽(yáng)性小球菌，多呈短鏈狀，成對(duì)或分散排列（圖1C）。

從形態(tài)學(xué)觀察，26例高齲患者中22例檢出變異鏈球菌，從其中的10例受試者分別挑取1株形態(tài)典型的變異鏈球菌株，另外10例受試者分別挑取2株形態(tài)典型的變異鏈球菌株，最后2例受試者分別挑取3株形態(tài)典型的變異鏈球菌株，共36株；14例無(wú)齲健康人中有10例檢出變異鏈球菌，分別挑取1株形態(tài)典型的變異鏈球菌株，共10株。將上述46株形態(tài)典型的變異鏈球菌臨床分離株依次編號(hào)（1～46號(hào)），進(jìn)行下一步研究。

2.2 細(xì)菌生化鑒定

對(duì)形態(tài)學(xué)觀察具有變異鏈球菌典型形態(tài)的臨床分離株，進(jìn)行傳統(tǒng)的生化鑒定。甘露醇、山梨醇、棉子糖和密二糖的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性者為黃色，七葉苷水解實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性者為黑色，精氨酸水解實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性者為紅色，加3%過氧化氫后產(chǎn)生大量氣泡者為觸媒實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。主要生化特性鑒定見表2。46株變異鏈球菌臨床分離株與變異鏈球菌國(guó)際參考株Ingbritt對(duì)各個(gè)生化試劑的反應(yīng)結(jié)果相同。

2.3 自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定

分別采用半自動(dòng)API 20 Strep鑒定條和全自動(dòng)VITEK 2微生物分析儀對(duì)已經(jīng)過傳統(tǒng)生化反應(yīng)初步鑒定為變異鏈球菌的臨床分離株進(jìn)行鑒定，其結(jié)果見表3。API 20 Strep結(jié)果中的鑒定百分比是將菌株的生化反應(yīng)與資料庫(kù)中的所有菌株比對(duì)的結(jié)果，即為鑒定概率。鑒定百分比的值越高，結(jié)果越吻合。表3中T值為同一菌株各項(xiàng)生化反應(yīng)的典型程度，反應(yīng)鑒定的可靠性；T值越接近1，菌株生化反應(yīng)的程度越典型。由表3可見：國(guó)際參考株Ingbritt的鑒定概率為99.9%，T值為1，概率生物為99.00%，可信度為優(yōu)質(zhì)可信，說明半自動(dòng)API 20 Strep鑒定條和全自動(dòng)VITEK 2微生物分析儀的鑒定結(jié)果是可信的。除菌株1的T值為0.90、概率生物為94.50%，菌株2的T值為0.78，菌株3的T值為0.80、概率生物為91.15%、可信度為可信，菌株4的T值為0.90、概率生物為94.95%，菌株5的T值為0.75外，其余菌株的T值均在0.91和1之間，概率生物在95.00%和98.00%之間，可信度為優(yōu)質(zhì)可信或非常可信，說明經(jīng)自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定的臨床分離株1～46均為變異鏈球菌。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

分別以變異鏈球菌國(guó)際參考株Ingbritt、金黃色葡萄球菌臨床分離株188號(hào)和經(jīng)鑒定為變異鏈球菌臨床分離株的細(xì)菌基因組DNA為模板，以合成的spaP-F（R）、gtfB-F（R）和dexA-F（R）為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分別將各菌株的3個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳圖譜顯示46株變異鏈球菌臨床分離株及陽(yáng)性對(duì)照變異鏈球菌國(guó)際參考株Ingbritt的擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一條帶，其大小分別為192、517和1 272 bp（圖2），與預(yù)期相同；而陰性對(duì)照金黃色葡萄球菌臨床分離株188號(hào)無(wú)目的條帶出現(xiàn)。

2.5 基因分型鑒定

使用OPA5引物以隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增46株變異鏈球菌臨床分離株基因組DNA，進(jìn)行基因分型鑒定，結(jié)果顯示：46株臨床分離株中，有5株變異鏈球菌的基因型與其他菌株相同。46株臨床分離株和5株與其他菌株基因型相同的臨床分離株的來(lái)源見表4。去除5株與其他菌株基因型相同的變異鏈球菌臨床分離株菌，本實(shí)驗(yàn)獲得41株基因型不同的變異鏈球菌臨床分離株，其基因分型分析結(jié)果見圖3。圖3中電泳條帶上面的橫線表示菌株的相似度，豎線指示的是每一個(gè)菌株及相似度相同的菌株，由此可以得出46株臨床分離株基因分型的相似程度。

3 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織關(guān)于齲病流行嚴(yán)重程度的標(biāo)準(zhǔn)[8]，并參考其他文獻(xiàn)[9]，本研究將DMFT指數(shù)≥6者確定為高齲患者，DMFT=0者確定為無(wú)齲健康人。

本研究采用的研究樣本為牙菌斑，取樣位點(diǎn)為受試者口腔內(nèi)無(wú)齲損的釉質(zhì)光滑面。研究[10]表明：牙

菌斑和唾液樣本是良好的口腔變異鏈球菌研究對(duì)象。本研究的目的是為了獲得確實(shí)可靠的變異鏈球菌臨床分離株，且齲病形成的先決條件是牙菌斑的形成，所以采用牙菌斑作為研究樣本。研究[11-12]發(fā)現(xiàn)：變異

鏈球菌的定植存在部位差異性，完整的牙齒表面和齲壞牙面以及牙冠不同部位，變異鏈球菌的數(shù)量和比例都是不同的。為了避免因部位因素而影響菌斑中變異鏈球菌檢出情況，本研究的取樣位點(diǎn)均為無(wú)齲損的釉質(zhì)光滑面。

口腔中的菌群數(shù)量多、種類復(fù)雜，為了能夠從牙菌斑中獲得變異鏈球菌的純培養(yǎng)物，本研究采用具有選擇及鑒定功能的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的分離與培養(yǎng)。研究[1]表明，變異鏈球菌和表兄鏈球菌（Strepto-coccus sobrinus，又稱遠(yuǎn)緣鏈球菌或茸毛鏈球菌）是人類最主要的致齲菌，是具有相似表型特征而遺傳型和分子組成不同的異源性細(xì)菌。雖然變異鏈球菌在人類口腔中的檢出率最高，可達(dá)90%以上，但表兄鏈球菌的檢出率也可達(dá)10%～76%，因此，本研究中細(xì)菌培養(yǎng)的重點(diǎn)在于區(qū)分上述兩種細(xì)菌。研究[2]證實(shí)，TYCSB培養(yǎng)基在變異鏈球菌培養(yǎng)方面與其他選擇性培養(yǎng)基比較具有高靈敏性、高特異性及保存時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)的特點(diǎn)，并且通過菌落形態(tài)的差異可以區(qū)分出變異鏈球菌與表兄鏈球菌。本研究在細(xì)菌初代培養(yǎng)時(shí)采用TYCSB培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)兩種典型的菌落形態(tài)，一種為較小的邊界清楚的白色菌落，另一種為邊界模糊的黃白色菌落。因?yàn)樵撆囵B(yǎng)基中添加了可以有效抑制牙菌斑中大部分細(xì)菌生長(zhǎng)的桿菌肽和高濃度蔗糖[13]，所以上述兩種形態(tài)的菌落可能是來(lái)源

于變異鏈球菌和表兄鏈球菌。雖然MSB培養(yǎng)基不能明顯區(qū)分以上兩個(gè)菌種且保存時(shí)間較短，但仍是分離培養(yǎng)變異鏈球菌時(shí)應(yīng)用最為廣泛的培養(yǎng)基；因此，本研究將具有典型菌落形態(tài)的單個(gè)菌落分別接種于MSB培養(yǎng)基進(jìn)行次代純化培養(yǎng)。次代培養(yǎng)后，可看到兩種菌落形態(tài)：一種菌落呈深藍(lán)色嵌頓狀態(tài)，質(zhì)硬，表面粗糙有突起，邊緣不齊；另一種為藍(lán)褐色，突起，表面覆蓋有水滴樣的蓋帽狀物。經(jīng)革蘭染色鏡下觀察，兩種菌落均為格蘭陽(yáng)性小球菌，前者多呈短鏈狀，成對(duì)或分散排列；后者長(zhǎng)鏈狀居多，成對(duì)或鏈狀排列，與文獻(xiàn)[14]報(bào)道相近。綜合選擇性培

養(yǎng)基上菌落形態(tài)及革蘭染色觀察所見，可以初步認(rèn)定變異鏈球菌的菌落特征為：TYCSB培養(yǎng)基上為較小的邊界清楚的白色菌落，MSB培養(yǎng)基上為深藍(lán)色嵌頓、質(zhì)硬、表面粗糙有突起、邊緣不齊的菌落，鏡下觀察呈短鏈狀，成對(duì)或分散排列。

為確保分離培養(yǎng)出的變異鏈球菌臨床分離株的可靠性，本研究采用從傳統(tǒng)的生化反應(yīng)到自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)再到分子生物學(xué)等多種方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。生化反應(yīng)鑒定結(jié)果顯示：46株臨床分離株符合變異鏈球菌的生化特性。API 20 Strep鑒定條或VITEK 2全自動(dòng)微生物分析儀分析均為目前臨床微生物檢

驗(yàn)時(shí)常用的微量快速且具有高準(zhǔn)確性的鑒定方法，其中API 20 Strep手工鑒定條更被認(rèn)為是細(xì)菌鑒定的全球標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示：盡管各菌株的鑒定概率有一定程度的差別，但均被證實(shí)為變異鏈球菌；其中，VITEK 2分析儀的鑒定概率小于API 20 Strep的原因可能是由于兩種方法對(duì)準(zhǔn)確率的初始設(shè)置不同所致。PCR技術(shù)具有高特異性、高敏感性的特點(diǎn)，對(duì)于細(xì)菌的鑒定具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前已經(jīng)用于變異鏈球菌鑒定的基因片段有表面蛋白spa基因[3]、葡

糖基轉(zhuǎn)移酶gtf基因[4]、葡聚糖酶dex基因[5]和16S rRNA基因[15]等。spaP基因表達(dá)的變異鏈球菌表面蛋白能

夠促進(jìn)該菌對(duì)牙面的黏附與定植；gtfB基因表達(dá)的非水溶性葡糖基轉(zhuǎn)移酶有利于蔗糖作為底物合成水不溶性葡聚糖，后者參與了該菌的蔗糖依賴性黏附；dexA基因表達(dá)的葡聚糖酶不僅可降解葡聚糖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且可以與葡聚糖結(jié)合使該菌保持更加牢固且易黏附的形式。本研究選用spaP、gtfB和dexA基因作為目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示：46株變異鏈球菌臨床分離株及國(guó)際參考株Ingbritt的擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一條帶，目的片段大小與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3-5]，

而陰性對(duì)照菌株無(wú)目的條帶出現(xiàn)。該結(jié)果證實(shí)46株臨床分離株均為變異鏈球菌。

經(jīng)過細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)、自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)和分子生物學(xué)鑒定的變異鏈球菌臨床分離株，有可能具有相同的基因型；本研究使用OPA5引物以隨機(jī)引物PCR對(duì)46株變異鏈球菌臨床分離株進(jìn)行基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)5株變異鏈球菌臨床分離株基因型與其他菌株相同。研究[16-17]發(fā)現(xiàn)：口腔中變異鏈球

菌基因型數(shù)量與患齲情況有關(guān)，患齲者多于無(wú)齲者；口腔環(huán)境的變化對(duì)變異鏈球菌基因型的數(shù)量也有影響，暴露于蔗糖環(huán)境者變異鏈球菌基因型數(shù)量多于暴露于水環(huán)境者。本研究發(fā)現(xiàn)的5株相同基因型的變異鏈球菌均來(lái)源于同一受試者中分離培養(yǎng)多于1株的受試者，而不同受試者的基因型不同。經(jīng)過基因型鑒定，剔除5株基因型相同的變異鏈球菌臨床分離株后，本研究得到了41株基因型不同的變異鏈球菌臨床分離株，可以用于齲病臨床和基礎(chǔ)研究。

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（本文編輯 吳愛華）