肌上皮細胞在大鼠腮腺萎縮過程中的轉(zhuǎn)歸

趙騰達　左金華　王麗芳等

[摘要] 目的 研究大鼠腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎后萎縮腮腺內(nèi)肌上皮細胞（MEC）的轉(zhuǎn)歸規(guī)律。方法 通過結(jié)扎大鼠右側(cè)腮腺主導(dǎo)管誘導(dǎo)腺體萎縮，采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察正常腮腺及導(dǎo)管結(jié)扎后1、3、5、7、14、21、30、60、100、150 d萎縮性腮腺的組織學(xué)變化，并采用免疫組織化學(xué)染色方法定量分析MEC在腮腺萎縮不同時間點的數(shù)量及分布情況。結(jié)果 組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：腮腺主導(dǎo)管結(jié)扎5 d后，大部分腺泡細胞出現(xiàn)凋亡喪失，在腺體萎縮過程中形成大量導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)，間質(zhì)逐漸纖維化并伴有炎性細胞浸潤。免疫組織化學(xué)染色定量分析結(jié)果顯示：導(dǎo)管結(jié)扎后5 d內(nèi)，MEC數(shù)量快速增加，隨后其數(shù)量增長緩慢，維持在一定的范圍內(nèi)，100 d時MEC數(shù)量達到峰值，其后快速減少；在腮腺萎縮早期，MEC位于腺泡及閏管表面，呈星形或梭形，隨著腺體的萎縮，最終呈梭形分布于導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的外層。結(jié)論 在導(dǎo)管結(jié)扎后5 d內(nèi)，MEC出現(xiàn)反應(yīng)性大量增殖，隨后數(shù)量增長緩慢，維持在一定的范圍內(nèi)；隨著腮腺的逐漸萎縮，100 d后MEC數(shù)量快速減少。

[關(guān)鍵詞] 肌上皮細胞； 腮腺； 萎縮； 導(dǎo)管結(jié)扎

[中圖分類號] R 780.2 [文獻標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.007 由于受到頭頸部腫瘤放射治療、舍格倫綜合征及唾液腺炎等因素的影響，人體大唾液腺會出現(xiàn)腺體萎縮和唾液分泌功能下降等現(xiàn)象，給患者的生理、心理帶來嚴重的影響，但目前尚無有效的治療手段。如何治療唾液腺萎縮和促進腺體功能恢復(fù)已經(jīng)日益引起人們的重視。在唾液腺組織成分中，肌上皮細胞（myoepithelial cell，MEC）被普遍認為是可能導(dǎo)致唾液腺腫瘤（包括多形性腺瘤、肌上皮瘤等）發(fā)生的潛能祖細胞之一[1]，其內(nèi)含肌動蛋白，能夠接受交感

及副交感神經(jīng)α1-腎上腺素受體及毒蕈堿受體的協(xié)同誘導(dǎo)作用而發(fā)生收縮，促進腺泡及導(dǎo)管的分泌[2]，抑

制唾液腺的萎縮。目前對長期萎縮性腮腺內(nèi)MEC病理變化的研究仍然較少。本實驗通過結(jié)扎大鼠腮腺主導(dǎo)管[1，3]誘導(dǎo)腺體發(fā)生漸進性萎縮，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法定量測定MEC在萎縮性腮腺不同時間點的數(shù)量及分布，結(jié)合腺體的組織學(xué)變化，觀察MEC在腮腺萎縮過程中的轉(zhuǎn)歸規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

成年健康的雄性SD大鼠66只，體重（300±20） g，購于山東綠葉制藥有限公司。66只大鼠隨機分為11組，每組6只，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 實驗方法

用質(zhì)量分數(shù)3%水合氯醛行腹腔內(nèi)注射麻醉，劑量為10 mL·kg-1。麻醉后將大鼠右側(cè)腮腺嚼肌區(qū)備皮后置于無菌操作臺上，消毒，于右耳前下方作長約1 cm的縱形小切口，暴露眶外淚腺；在眶外淚腺下極的中部分離出咬肌表面的腮腺主導(dǎo)管及伴行神經(jīng)，用3—0絲線結(jié)扎腮腺主導(dǎo)管，縫合皮膚。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，分別將各組大鼠于導(dǎo)管結(jié)扎后第0（正常對照

組）、1、3、5、7、14、21、30、60、100、150天處死，切取右側(cè)腮腺，放入質(zhì)量分數(shù)4%的多聚甲醛固定液中固定。

1.3 組織學(xué)觀察

各組動物的腮腺組織樣本固定24 h后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，然后浸蠟、包埋，制成4 μm厚切片，行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，置于光鏡下觀察腮腺的組織學(xué)變化。

1.4 免疫組織化學(xué)觀察

采用特異性α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）對腮腺標(biāo)本進行免疫組織化學(xué)染色，染色采

用SABC法，抗體稀釋度為1∶250，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，觀察MEC的表達情況。

1.5 MEC計數(shù)及統(tǒng)計分析

將免疫組織化學(xué)切片放置于Olympus BX51型（Olympus公司，日本）顯微鏡的高倍鏡下觀察。每張切片隨機選擇5個視野拍照，采用ImagePro Plus 6.0圖像軟件計數(shù)MEC的數(shù)目。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，各組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察結(jié)果

導(dǎo)管結(jié)扎1 d時，大鼠右側(cè)腮腺的體積較正常對照組明顯增大，腺小葉水腫、分界不清；3 d時，腺體體積恢復(fù)正常；7 d時，腺體體積明顯減小。隨著導(dǎo)管結(jié)扎時間的延長，腺體組織逐漸縮小，色澤加深呈灰色，質(zhì)地變韌；小葉間隔增厚，并可分離縮小的腺小葉。結(jié)扎100 d時，腺體縮小明顯，體積約為正常腺體的一半；150 d時，腺體組織內(nèi)完全看不到腺小葉結(jié)構(gòu)。

2.2 組織學(xué)觀察結(jié)果

正常對照組：腮腺組織正常；覆蓋在腺體表面的纖維結(jié)締組織被膜深入腺實質(zhì)，將腺體分成許多腺葉和腺小葉，腺實質(zhì)內(nèi)見有漿液性腺泡及導(dǎo)管系統(tǒng)（閏管、紋管及排泄管），腺泡細胞大小均勻，排列規(guī)則（圖1A）。結(jié)扎1 d組，腮腺內(nèi)除可見部分導(dǎo)管擴張以外，腺實質(zhì)與正常對照組基本相似。3 d組，腺小葉的排列開始出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象，腺泡細胞未見消失。5、7 d組，腮腺的腺體組織出現(xiàn)較明顯的變化：大部分腺泡細胞消失，殘余腺泡局限于腺小葉周邊，導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)明顯；小葉間隔增厚，內(nèi)有單核細胞浸潤（圖1B）。14 d組，腺體內(nèi)腺泡萎縮嚴重，導(dǎo)管樣

結(jié)構(gòu)數(shù)目明顯增加，單核細胞（主要為巨噬細胞）浸潤在殘余導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)內(nèi)，小葉間隔纖維化并有大量淋巴細胞浸潤。21 d組，導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)幾乎組成了整個腺實質(zhì)，在腺實質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)存在淋巴細胞浸潤。30 d組，腮腺內(nèi)基本只包括擴張的導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)，由纖維結(jié)締組織包繞，小葉間隔呈致密纖維化，并包含部分淋巴細胞及少數(shù)排泄管。60 d組，腺體內(nèi)導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)目減少，出現(xiàn)不規(guī)則擴張（圖1C）。100 d組，

導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)異形更加明顯，管腔繼續(xù)呈圓形擴張。150 d組，導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)及異形導(dǎo)管數(shù)量減少，腺實質(zhì)廣泛纖維化并逐漸代替腺體組織，已無明顯淋巴細胞浸潤（圖1D）。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

經(jīng)免疫組織化學(xué)染色觀察MEC的分布及形態(tài)變化見圖2、3。在正常對照組及1 d組，腺泡及閏管邊緣可觀察到少量陽性表達的MEC（圖2A）；3 d組的

MEC在腺泡表面呈星形，而在閏管處則呈梭形（圖

3A）；5 d及7 d組可觀察到MEC數(shù)目明顯增加，其形態(tài)變化由梭形至星形不等，主要位于導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)周圍（圖2B）。隨著腺體的萎縮，腺泡細胞的完全喪失及大量導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，21、30 d組可觀察到腺實質(zhì)內(nèi)的大導(dǎo)管幾乎全部被梭形的MEC所包繞，導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)呈典型的雙套層結(jié)構(gòu)，大量陽性表達的MEC主要位于外層；60、100 d組導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的管腔繼續(xù)呈圓形擴張，數(shù)量減少，MEC陽性表達的表現(xiàn)類似于30 d組（圖2C）；150 d組的導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)管腔變小，

MEC呈梭形包繞在導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的外層（圖3B），MEC數(shù)量較前幾組明顯減少（圖2D）。

A：腮腺萎縮早期（3 d組），MEC在腺泡表面呈星形（空箭頭），在閏管處呈梭形（黑箭頭）；B：腮腺萎縮晚期（150 d組），MEC呈梭形（黑箭頭），包繞在導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的外層。

Fig 3 Morphology of MEC during the early and late phase of

glandular atrophy oil immersion lens × 1 000

2.4 MEC計數(shù)結(jié)果

腮腺導(dǎo)管結(jié)扎后不同時間點的MEC計數(shù)結(jié)果見表1。由表1可見：導(dǎo)管結(jié)扎后MEC數(shù)量顯著增加，尤以5 d組增加最快，100 d達到最大值之后數(shù)量又迅速減少。經(jīng)單因素方差分析，各時間點的MEC數(shù)符合正態(tài)分布及方差齊性（P=0.069），采用LSD法進行多重比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常對照組MEC數(shù)除與1、150 d組無明顯差異外，與其他各組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；3 d組與150 d組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義

（P>0.05），與其他各組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<

0.05）；自結(jié)扎第5天起，5 d組與隨后的7、14、21、30、60 d組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；而100 d

組除與14、21、30、60 d組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義外（P>0.05），與其他各組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<

0.05）。

3 討論

腺體萎縮是唾液腺疾病中最常見的病理變化，其萎縮過程較復(fù)雜。早期唾液腺萎縮可引起分泌功能減退，導(dǎo)致唾液流量減少。這一現(xiàn)象有學(xué)者[4]認為是

由炎癥反應(yīng)引起的，但Correia等[5]則認為非炎性機制（如腺泡萎縮）可能是主要原因。目前關(guān)于導(dǎo)管結(jié)扎后快速誘導(dǎo)腺體萎縮的具體機制仍不清楚。Takahashi

等[6]發(fā)現(xiàn)：Fas/FasL通過激活Caspase-8和Caspase-3，可以在誘導(dǎo)唾液腺細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。通過結(jié)扎腮腺主導(dǎo)管誘導(dǎo)腺體萎縮，可觀察到如下典型變化：腺泡細胞的凋亡喪失，大量導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，腺實質(zhì)逐漸纖維化并炎性細胞的浸潤，以及MEC的數(shù)量、位置及形態(tài)的改變。在萎縮過程中MEC在一定程度上能夠抑制腺體的萎縮[3]。Walker等[7]發(fā)現(xiàn)：在正常唾液腺內(nèi)很少觀察到MEC，但隨著腺體的漸進性萎縮，MEC陽性表達明顯，并最終完全圍繞在導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)周圍；而Takahashi等[8]證實MEC在腺體

萎縮晚期的存活通過表達Bcl-2來維持。此外，MEC在繼發(fā)性舍格倫綜合征患者唾液腺炎癥病變過程中亦可能作為靶細胞，被淋巴細胞浸潤破壞后最終導(dǎo)致腺泡和導(dǎo)管上皮的喪失[9]。還有研究[10-11]發(fā)現(xiàn)：MEC的形態(tài)差異可能與唾液腺病理萎縮狀態(tài)有一定的相關(guān)性，在萎縮唾液腺的腺泡表面包繞著典型的星狀MEC可作為腺體功能恢復(fù)的早期征象。

本研究觀察到，腮腺導(dǎo)管結(jié)扎1 d后，MEC平均數(shù)（641.00）較正常對照組（566.50）稍有增多，3 d組（945.50）明顯增多，5 d組（1 430.25）的數(shù)量甚至達到正常對照組的2.5倍，這表明MEC在導(dǎo)管結(jié)扎后大量快速增殖，尤以導(dǎo)管結(jié)扎5 d時增加最多。導(dǎo)管結(jié)扎后5～30 d內(nèi)，MEC數(shù)量雖有增加，但都維持在一定的范圍內(nèi)。該結(jié)果與Burgess等[1]觀察到的MEC增殖

活性的結(jié)論相一致。腮腺導(dǎo)管結(jié)扎1周后，MEC環(huán)繞在部分殘余導(dǎo)管表面，并發(fā)生形態(tài)變化，呈梭形至星形不等。筆者認為，MEC自身增殖以及對導(dǎo)管阻塞的抵抗效應(yīng)是引起其數(shù)量增多的重要因素。

在腮腺萎縮過程中，腺泡細胞消失及導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)導(dǎo)致腺體組織變化較大，因此MEC在腺體中的數(shù)量不僅與腺泡數(shù)量的多少有關(guān)，還與其本身的分布有關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)7 d組的MEC數(shù)量較5 d組略微減少，這可根據(jù)Burgess等[3]的觀點進行解釋：MEC

在萎縮過程中的變化主要與相鄰的閏管有關(guān)，閏管在該期的增多導(dǎo)致單位視野內(nèi)MEC相對減少，而腺泡細胞在該時間點的持續(xù)喪失亦可能是導(dǎo)致MEC數(shù)目減少的另一因素。至于腺泡表面的MEC是否隨腺泡消失而自身發(fā)生凋亡，還是遷移到新增的導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)表面，仍需進一步研究。此外，60 d組MEC數(shù)量較30 d時減少，100 d達到峰值，150 d又迅速減少。通過觀察腮腺的組織學(xué)變化可以發(fā)現(xiàn)：30 d時腺實質(zhì)內(nèi)存在大量小的圓形導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)；60 d時出現(xiàn)大的不規(guī)則的導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)，管腔擴張；100 d時可見導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)異形明顯；150 d時異形導(dǎo)管及導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)數(shù)量減少，管腔變??；此外還發(fā)現(xiàn)鄰近導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)有融合趨勢。因此可以認為：30～150 d內(nèi)的腮腺萎縮過程中，受間質(zhì)結(jié)締組織纖維化壓力作用的影響，相鄰多個小導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)發(fā)生融合形成大的不規(guī)則導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)，該改建過程引起MEC數(shù)量的暫時增加，融合完畢后受周圍壓力的繼續(xù)影響，最終導(dǎo)致MEC數(shù)量減少，導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)異形減少，管腔變小并逐漸呈圓形。因此，在唾液腺萎縮晚期MEC所環(huán)繞的大導(dǎo)管的擴張，除考慮小導(dǎo)管融合外，亦與對腮腺的萎縮抑制效應(yīng)有關(guān)。

總之，在腮腺導(dǎo)管結(jié)扎5 d后，MEC呈現(xiàn)反應(yīng)性大量增殖，隨后數(shù)量增長緩慢，維持在一定的范圍內(nèi)，隨著腮腺腺體的萎縮，100 d后MEC數(shù)量快速減少，150 d時接近正常水平。此外，MEC在腮腺萎縮過程中的形態(tài)變化，可對判斷腺體萎縮程度及選擇治療時機提供理論依據(jù)。通過研究MEC在腮腺萎縮過程中的轉(zhuǎn)歸規(guī)律，對唾液腺輻射防護及腺體萎縮的治療具有積極的指導(dǎo)意義。

[參考文獻]

[1] Burgess KL， Dardick I， Cummins MM， et al. Myoepithelial cells

actively proliferate during atrophy of rat parotid gland[J]. Oral Surg

Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod， 1996， 82（6）：674-680.

[2] Lung MA. Autonomic nervous control of myoepithelial cells and

secretion in submandibular gland of anaesthetized dogs[J]. J Phy-

siol， 2003， 546（Pt 3）：837-850.

[3] Burgess KL， Dardick I. Cell population changes during atrophy

and regeneration of rat parotid gland[J]. Oral Surg Oral Med Oral

Pathol Oral Radiol Endod， 1998， 85（6）：699-706.

[4] Carpenter GH， Osailan SM， Correia P， et al. Rat salivary gland

ligation causes reversible secretory hypofunction[J]. Acta Physiol

（Oxf）， 2007， 189（3）：241-249.

[5] Correia PN， Carpenter GH， Osailan SM， et al. Acute salivary gland

hypofunction in the duct ligation model in the absence of inflam-

mation[J]. Oral Dis， 2008， 14（6）：520-528.

[6] Takahashi S， Gobe GC， Yoshimura Y， et al. Participation of the

Fas and Fas ligand systems in apoptosis during atrophy of the rat

submandibular glands[J]. Int J Exp Pathol， 2007， 88（1）：9-17.

[7] Walker NI， Gobé GC. Cell death and cell proliferation during atro-

phy of the rat parotid gland induced by duct obstruction[J]. J Pa-

thol， 1987， 153（4）：333-344.

[8] Takahashi S， Yoshimura Y， Yamamoto T， et al. Cellular expres-

sion of Bcl-2 and Bax in atrophic submandibular glands of rats

[J]. Int J Exp Pathol， 2008， 89（5）：303-308.

[9] Hayashi T， Hayashi H， Fujii T， et al. Ultrastructure of myoepithe-

lial cells as a target cell in sialoadenitis of submandibular glands

of lupus-prone female NZBxNZWF1 mice[J]. Virchows Arch， 2008，

453（2）：177-188.

[10] Cotroneo E， Proctor GB， Paterson KL， et al. Early markers of re-

generation following ductal ligation in rat submandibular gland[J].

Cell Tissue Res， 2008， 332（2）：227-235.

[11] Elewa YH， Bareedy MH， Abuel-Atta AA， et al. Cytoarchitectural

differences of myoepithelial cells among goat major salivary glands

[J]. Vet Res Commun， 2010， 34（6）：557-567.

（本文編輯 吳愛華）