玉米自交系許178背景的綜3染色體單片段代換系的構(gòu)建

毛克舉，李衛(wèi)華，付志遠，丁 冬，湯繼華

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州450002)

明確農(nóng)作物重要農(nóng)藝性狀的遺傳機制對選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的新品種具有重要的理論意義.然而，由于農(nóng)作物的產(chǎn)量和重要農(nóng)藝性狀多數(shù)表現(xiàn)為典型的數(shù)量性狀，因此，構(gòu)建不同的分離群體通過QTL定位的方法對其遺傳機制進行分析成為數(shù)量性狀研究的基礎(chǔ).玉米等作物常用的分離群體主要有 F2，BC1，RIL，DH，IF2等初級作圖群體.在利用這些群體對數(shù)量性狀進行遺傳研究過程中，由于數(shù)量性狀自身表現(xiàn)的復(fù)雜性，QTL定位往往難以取得令人滿意的結(jié)果［1］.染色體單片段代換系(single segment substitution line，SSSL)概念的提出及大量群體的構(gòu)建為數(shù)量性狀的研究開辟了一個新的途徑［2～4］.染色體單片段代換系在受體的遺傳背景上只有一個染色體片段被相應(yīng)供體的染色體片段所代替，具有片段單一、背景一致、遺傳穩(wěn)定等特點，可以在群體水平上把復(fù)雜性狀的多基因系統(tǒng)分解為簡單的孟德爾遺傳因子，為數(shù)量性狀基因的鑒定、精細定位、克隆以及應(yīng)用提供保障［3］.在SSSL群體利用中，ESHED等率先以栽培番茄Lycopersicon esculentum為遺傳背景的50個野生綠果番茄Lycopersicon pennelliide單片段導(dǎo)入系為試驗材料，檢測出23個番茄可溶性固含物QTL和18個番茄果實體積 QTL［4］.SSSLs群體已經(jīng)在番茄、水稻、小麥、玉米、小白鼠等動植物的遺傳中發(fā)揮了重要作用，顯示了其在數(shù)量性狀遺傳研究的獨特優(yōu)勢［4～6］.但是與其他作圖群體相比，SSSLs的構(gòu)建需要通過多代的回交同時結(jié)合分子標記輔助選擇，煩瑣費時，限制了染色體單片段代換系的廣泛應(yīng)用.新品種的選育與推廣是保證其產(chǎn)量持續(xù)提高的一條有效措施，而對玉米產(chǎn)量和重要農(nóng)藝性狀遺傳機理進行剖析可以為玉米新品種的選育提供理論依據(jù)［7］.在中國玉米育種所利用的骨干自交系中，許178具有綜合抗病強、適應(yīng)性廣、對低氮和低磷反應(yīng)遲鈍等突出優(yōu)點［8］，而自交系綜3則具有配合力高等突出優(yōu)點，但表現(xiàn)出對水分、低氮等逆境條件下敏感的特點，本研究擬以綜3為供體親本、許178為受體親本，構(gòu)建一套許178遺傳背景的綜3單片段代換系庫，為鑒定具有特殊性狀的單片段代換系提供材料基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用試驗材料中國玉米育種中的2個骨干自交系綜3和許178，這2個自交系分別是大量推廣玉米雜交種豫玉22號和農(nóng)大108的親本自交系.

1.2 試驗方法

基于IBM 2008 Neighbour整合的SSR分子標記連鎖圖譜，按照等間距的原則，選擇平均分布于10條染色體上700對SSR引物對許178和綜3進行多態(tài)性標記篩選.所有引物由上海生物工程有限公司合成.

田間試驗于2008—2011年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)(鄭州)和海南試驗基地(海南省樂東縣九所鎮(zhèn))進行.2010年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)種植BC3F1群體800行，每行10株，于5葉期按行號混合取樣，利用2個親本之間存在多態(tài)性的SSR標記對樣品混合DNA進行分析.同時在田間選擇與許178表現(xiàn)型存在差異的1 300個單株進行回交，于2010年冬在海南加代自交.2011年將BC4F2材料在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)種植成株系，每個株系種5株，用上一代篩選出的差異標記跟蹤檢測代換片段，每個株系檢測1～2株，從中選出含有純合供體片段的單片段代換系.在BC4F2沒有獲得純合單片段的材料，選取含有雜合單片段材料的自交后代，在BC4F3利用分子標記進行篩選，選擇純合的單片段代換系材料.單片段代換系的構(gòu)建過程如圖1所示.

圖1 單片段代換系群體的構(gòu)建過程Fig.1 The construction procedure of the single segment substitution line

1.3 供體染色體片段長度的計算方法

參照YOUNG等［9］的方法計算代換片段長度.不考慮2個相鄰標記區(qū)間發(fā)生的雙交換事件，當(dāng)染色體上相鄰標記的基因型相同時，則認為這2個標記之間的區(qū)段由相同的標記基因型組成.當(dāng)染色體上相鄰標記的基因型不同時，就認為這2個標記基因型分別組成這個區(qū)間的一半.按照微衛(wèi)星標記連鎖圖IBM Neighbour 2008上標記間的距離計算供體片段的長度 (www.maizegdb.org).

2 結(jié)果與分析

2.1 供體親本與受體親本之間的標記多態(tài)性

基于IBM 2008 Neighbour整合的SSR分子標記連鎖圖譜，按照等間距的原則，選用玉米基因組中的700對SSR引物對2個親本進行多態(tài)性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有200對SSR引物在親本間存在多態(tài)性，多態(tài)率為28.57%(圖2).選用其中172對帶型明顯、易記錄的SSR標記用于回交后代的供體片段檢測，每條染色體上的SSR標記為12～25，標記之間的平均圖距為51.58 cM.

圖2 親本多態(tài)性的篩選Fig.2 Screening of parental polymorphism

2.2 單片段代換系群體中的代換片段

經(jīng)過多代回交、自交結(jié)合SSR分子標記檢測與選擇，剔除不同單片段代換系之間的重復(fù)，在BC4F2和BC4F3分離群體中共篩選選到100份純合的單片段代換系材料(表1).

本研究所獲得的100個單片段代換系的代換片段不均勻的分布在玉米10條染色體上，其中代換片段數(shù)最多的為第1條染色體，含有22個片段;其次是第2條染色體，含有16個片段;最少的為第5條和第7條染色體，均僅有4個片段.覆蓋率最高的是玉米第4條染色體，覆蓋率為80.24%;覆蓋率最少的為第6條染色體，僅有21.07%(圖3).

表1 各染色體上的代換片段及其覆蓋率Table 1 Distribution and coverage condition of donor substitution segments

所有代換片段長度為2.25～186.03 cM，總長度為5 314.80 cM，平均長度為 53.15 cM，覆蓋玉米基因組的47.85%.其中分布在 2.25 ～50.00 cM的代換片段最多，有55個，占單片段代換系總數(shù)的55.00%;代換片段長度分布在 50.0 ～100.00 cM有33個，占33.00%;代換片段長度大于100.00 cM有12個，占12.00%.

3 討論

SSSL內(nèi)供體染色體片段的單一性，消除了遺傳背景及QTL之間互作的干擾，便于鑒定出功能細小的QTL;利用SSSL與受體表型性狀的簡單比較，可以把目標性狀QTL粗定位于代換片段上;利用不同SSSL之間染色體片段的部分重疊性，可以把數(shù)量性狀QTL定位到更小的區(qū)域內(nèi)(重疊區(qū)或非重疊區(qū)內(nèi))［2］.基于染色體單片段代換系在生物重要性狀遺傳研究中所具有的優(yōu)勢，構(gòu)建某個物種的染色體單片段代換系群體對于基因定位、克隆以及功能分析，和加快分子標記輔助聚合育種的進程具有重要作用［3］.在 SSSLs 群體構(gòu)建研究中，何風(fēng)華等［10］用 6個水稻品種為供體，1個優(yōu)良秈稻品種為受體，用回交和SSR分子標記輔助選擇相結(jié)合的方法，獲得了86 個SSSL，覆蓋水稻基因組57.10%.宋建東等［11］以粳稻日本晴為受體和輪回親本，以廣西普通野生稻核心種質(zhì)DP 15為供體，通過連續(xù)回交和SSR標記輔助選擇的方法獲得了79個SSSL，覆蓋水稻全基因組達98.89%.玉米染色體單片段代換系構(gòu)建方面，袁亮等［12］從BC3F1代開始進行標記跟蹤，通過BC3F1，BC4F1，BC4F2和 BC4F3分離群體的標記鑒定，獲得了74個以9801為遺傳背景的昌7－2染色體單片段代換系.張書紅［13］以玉米自交系綜3為供體，以87－1為受體親本，利用137個SSR分子標記，獲得84個單片段代換系群體.

染色體單片段代換系的構(gòu)建效率，與輪回親本的回交代數(shù)、起始檢測世代、檢測群體的大小、所利用的標記數(shù)目等均具有一定的關(guān)系.多輪回交的主要目的是重建受體背景［14］，以保持代換染色體不發(fā)生變化，回交代數(shù)增加將致使導(dǎo)入片段數(shù)量減少.統(tǒng)計結(jié)果表明，當(dāng)回交世代高于BC3以后，導(dǎo)入片段數(shù)一般少于4個;同時導(dǎo)入片段長度也將逐漸變短，導(dǎo)入片段平均長度平均在20 cM 以下［15］.本研究所獲得玉米單片段代換系群體的平均長度為53.15 cM，要大于理論上的平均導(dǎo)入片段長度，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的一個主要原因可能與本研究所利用的標記密度不夠有關(guān).因此，在以后的研究中應(yīng)該在不同單片段代換系之間篩選新的差異標記，構(gòu)建次級單片段代換系群體，以減少單片段代換系群體的供體染色體長度.

圖3 100個單片段代換系的染色體位置Fig.3 Chromosomal position of substitution segments of the 100 SSSLs population

此外，在染色體單片段代換系的構(gòu)建過程中，初始檢測群體的大小直接關(guān)系到群體構(gòu)建工作量，為提高構(gòu)建效率，初始檢測群體一般不需要很大，但分子標記數(shù)量要多，且要均勻分布在玉米10條染色體上，以便快速準確地確定群體內(nèi)代換片段的位置、長度和數(shù)目，便于后代的跟蹤選擇.由于多片段中間材料是選育單片段代換系的基礎(chǔ)，所以在試驗的起始階段就要注重構(gòu)建供體代換片段庫.本研究從BC3代開始利用分子標記進行供體代換片段檢測，由于每個家系內(nèi)導(dǎo)入片段數(shù)理論上一般為4個，在本研究所利用的800個BC3基礎(chǔ)家系中供體片段總數(shù)將達到3 200個，按每個片段的平均長度20 cM計算，供體片段總長度將超過640 000 cM，是玉米基因組的7倍以上，這些基礎(chǔ)材料為構(gòu)建覆蓋玉米全基因組的單片段代換系群體奠定了良好的材料基礎(chǔ).

［1］ 吳為人，唐定中，李維明.數(shù)量性狀的遺傳剖析和分子剖析［J］.作物學(xué)報，2000，26(4):501 －507.

［2］ 劉冠明，李文濤，曾瑞珍，等.水稻亞種間單片段代換系的建立［J］.中國水稻科學(xué)，2003，17(3):201－204.

［3］ 曾瑞珍，施軍瓊，黃朝鋒，等.秈稻背景的單片段代換系群體的構(gòu)建［J］.作物學(xué)報，2006，32(1):88 －95.

［4］ ESHED Y，ZAMIR D.A genomic library of Lycopersicon pennelliin L.esculentum:a tool for fine mapping of genes［J］.Euphytica，1994，79:175 －179.

［5］ 王立秋，趙永鋒，薛亞東，等.玉米銜接式單片段導(dǎo)入系群體的構(gòu)建和評價［J］.作物學(xué)報，2007，33(4):663－668.

［6］ 楊武云，胡曉蓉，毛 沛.采用橋梁單體培育小麥品種問染色體代換系的新方法［J］.華北農(nóng)學(xué)報，1997，12(4):23－27.

［7］ 李九云，于翠紅，高增玉.玉米種質(zhì)資源研究與發(fā)展趨勢探討［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，13(4):58－60.

［8］ 湯繼華，謝惠玲，黃紹敏，等.缺氮條件下玉米自交系葉綠素含量與光合效率的變化［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2005，20(5):10 －12.

［9］ YOUNG N D，TANKSLEY S D.Restiction fragment length polymorphism maps and the concept of graphical genotypes［J］.Theor Appl Genet，1989，77:95 － 101.

［10］何風(fēng)華，席章營，曾瑞珍，等.利用高代回交和分子標記輔助選擇建立水稻單片段代換系［J］.遺傳學(xué)報，2005，32(8):825 －831.

［11］宋建東，黃悅悅，陽海寧，等.粳稻為背景的普通野生稻單片段代換系群體的初步構(gòu)建［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，41(4):297 －302.

［12］袁 亮，丁 冬，李衛(wèi)華，等.玉米優(yōu)良自交系單片段代換系的構(gòu)建［J］.玉米科學(xué)，2011，20(2):52－55.

［13］張書紅.玉米單片段代換系群體的構(gòu)建和玉米矮花葉病抗病基因的定位［D］.鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［14］ LAW C N，WORLAND A J.Inter-varietal chromosome substitution lines in wheat revisited［J］.Euphytica，1996，89:1 －10.

［15］李文濤，曾瑞珍，張澤民，等.F1花粉不育性近等基因系導(dǎo)入片段的分析［J］.中國水稻科學(xué)，2003，l7(2):95－99.