菊芋小孢根霉固態(tài)發(fā)酵纖溶酶的工藝優(yōu)化

孫 哲，孫 瑤，王海寬

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

近年來(lái)我國(guó)心血管疾病的發(fā)病率大大增加，特別是腦血栓嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生命安全．因此如何防治，如何提高血栓病的防治水平，是醫(yī)藥學(xué)界亟需解決的問(wèn)題．目前溶栓治療方法主要有 3種：外科手術(shù)療法、器械療法、藥物療法[1–2]．其中，外科手術(shù)見(jiàn)效快，可是手術(shù)操作復(fù)雜、費(fèi)用高、有創(chuàng)傷、術(shù)后復(fù)發(fā)率也高[3]；器械療法受到一定的設(shè)備局限，其本身不影響血栓的凝血機(jī)制，并且作用時(shí)間短，所以需要與其他療法結(jié)合，一般不單獨(dú)使用；而藥物溶栓法是通過(guò)使用溶栓藥物，使血凝塊中的纖維蛋白降解成可溶物質(zhì)促使循環(huán)再通[4–5]，它與外科手術(shù)相比費(fèi)用低，與保守療法相比死亡率低．因此，研究廉價(jià)、溶栓效果好且安全的溶栓藥物具有重大的現(xiàn)實(shí)意義．

溶栓藥物來(lái)源廣泛，動(dòng)物、植物、微生物都有產(chǎn)纖溶酶的相關(guān)報(bào)道．自1987年日本學(xué)者Sumi等[6]發(fā)現(xiàn)納豆激酶(Nattokinase，NK)以后，通過(guò)微生物發(fā)酵方式獲得廉價(jià)、高效纖溶酶的方法引起業(yè)內(nèi)人士的興趣．1996年 Kim 等[7]從韓國(guó)傳統(tǒng)食品豆醬中分離到有纖溶活性的蛋白酶，命名為枯草激酶(CK)．杜連祥等[8]從南方小酒藥中發(fā)現(xiàn)具有纖溶酶活性的根霉(Rhizopus chiensis)12#，根霉纖溶酶僅作用于枯草桿菌蛋白酶和胰蛋白酶的底物，而不作用于凝血酶、尿激酶和胰蛋白酶的特異性合成底物，底物專一性好．2011年，Choi等[9]從蛹蟲(chóng)草中分離得到纖溶活性很強(qiáng)的溶栓酶，相對(duì)分子質(zhì)量為 3.4×104，能充分降解血纖維蛋白的 α、β和 γ–γ鏈．同年，Mander等[10]從鏈霉菌(Streptomyces sp. CS624)中分離得到一種纖溶酶，其相對(duì)分子質(zhì)量較小，為 1.8×104，N 端 15氨基酸序列為APNVDAIYLPQYRLS，與其他纖溶酶報(bào)道不同．2012年Rashad等[11]從生長(zhǎng)在葵花籽油蛋糕上的念珠菌中分離得到一種高相對(duì)分子質(zhì)量7.244×104的纖溶酶，被 Cu2+、Hg2+和碘乙酸完全抑制，但酶活力較強(qiáng)，是一種有潛力的溶栓藥劑．

本實(shí)驗(yàn)室從酒曲中分離出一株可降解纖維蛋白菌株，經(jīng)鑒定為菊芋小孢根霉．前期實(shí)驗(yàn)工作已經(jīng)證明該菌株所產(chǎn)蛋白酶為纖溶酶[1,12]．纖維蛋白平板實(shí)驗(yàn)證明具有很強(qiáng)纖溶活性，作為新一代溶栓抗凝藥物具有開(kāi)發(fā)潛能．由于菊芋小孢根霉在初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上產(chǎn)酶量?jī)H為(83.46±8.34)U/g，產(chǎn)量低，因而本文對(duì)菊芋小孢根霉的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝進(jìn)行研究，旨在提高酶產(chǎn)量．

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

由本實(shí)驗(yàn)室從酒曲中分離得到菊芋小孢霉Rhizopus microspores var. tuberosus[1]．

牛血纖維蛋白原、凝血酶和瓊脂糖，Sigma公司；其余試劑均為分析純或生化試劑．

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基．保存菌種接入斜面培養(yǎng)基，29,℃恒溫培養(yǎng)5,d．

發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮 25,g，豆粕 25,g，加水 50,mL，121,℃滅菌 20,min．用無(wú)菌水將斜面上的孢子洗下，轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的無(wú)菌生理鹽水中，振蕩，計(jì)數(shù)．用滅菌后的雙層紗布過(guò)濾得到孢子懸液，將其接入滅過(guò)菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中(孢子濃度 106,g-1)，29,℃恒溫培養(yǎng) 72,h．

1.3 粗酶液制備方法

發(fā)酵結(jié)束后，按 1∶5的比例向發(fā)酵物中加入無(wú)菌生理鹽水，充分振蕩，使發(fā)酵物均勻分散到生理鹽水中，4,℃浸提 5,h之后將浸提物在 8,000,r/min、4,℃條件下離心20,min，取上清液即為粗酶液．

1.4 酶活測(cè)定方法

纖維蛋白平板法，參考Astrup等[13]與Walton[14]方法，用尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品作纖溶酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線，37,℃保溫 16,h，其回歸方程為 Y＝1.624,X–1.666，R2＝0.994，其中 Y為酶活力(U/mL)的常用對(duì)數(shù)，X為溶圈最大與最小直徑乘積的常用對(duì)數(shù)．取待測(cè)樣品10,μL點(diǎn)在血纖維蛋白平板上，37,℃保溫 16,h后測(cè)定溶圈最大與最小直徑，通過(guò)上述回歸方程計(jì)算待測(cè)樣品酶活力，再換算出每克干基酶活力(U/g)．

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源的選擇

分別取麩皮、玉米粉、大米粉、面粉25,g，與25,g豆粕配制成不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，加水 50,mL，拌勻，29,℃發(fā)酵 72,h．按 1.4方法測(cè)酶活力，結(jié)果見(jiàn)表1．結(jié)果表明，麩皮作為碳源時(shí)酶活力最高，其活力為(134.57±13.26)U/g．

2.1.2 氮源的選擇

分別取大豆粉、豆粕粉、花生餅粉、棉子餅粉25,g作為氮源，另加入 25,g麩皮配制成不同氮源的培養(yǎng)基，其他條件同上，測(cè)得酶活力見(jiàn)表 2．結(jié)果表明，豆粕粉作為氮源時(shí)酶活力最高，為(201.46±20.14)U/g．

2.1.3 碳氮比的確定

以麩皮為碳源，豆粕粉為氮源，按比例1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1分別配制總量為 50,g的培養(yǎng)基，其他條件同上．不同碳氮比對(duì)產(chǎn)酶的影響如圖 1所示. 結(jié)果表明，當(dāng)碳氮比為2∶1時(shí)產(chǎn)酶量達(dá)到最大，其活力為(254.64±25.32)U/g．

表2 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Tab.2 Effect of nitrogen source on production of fibrinolytic enzyme

圖1 不同碳氮比對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of different carbon nitrogen ratio on production of fibrinolytic enzyme

2.1.4 培養(yǎng)基含水量對(duì)產(chǎn)酶的影響

水是生命生長(zhǎng)所必需的，菊芋小孢根霉發(fā)酵也不例外，尤其是好氧固態(tài)發(fā)酵對(duì)水量的要求相對(duì)更高，少量的水不能保證微生物體內(nèi)生化反應(yīng)的正常進(jìn)行，也就不能大量產(chǎn)酶；相反，水過(guò)量會(huì)使培養(yǎng)基黏稠，氧供應(yīng)困難，不利于菌體生長(zhǎng)．為確定最適宜的水含量，本實(shí)驗(yàn)向每克干基中分別加水 0.5、0.75、1.00、1.25、1.5、1.75、2.00,mL，發(fā)酵后測(cè)其活力，結(jié)果如圖2所示．結(jié)果表明：培養(yǎng)基中加水 1,mL/g(干基)酶產(chǎn)量最高，最高活力為(289.76±28.98)U/g．

圖2 不同含水量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of moisture of culture on production of fibrinolytic enzyme

2.1.5 培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)纖溶酶的影響

用HCl或者NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使pH在4～10范圍內(nèi)，發(fā)酵后分別測(cè)酶活力，結(jié)果如圖 3所示．結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為5時(shí)，酶活力最高，達(dá)到(302.46±15.12)U/g．由于原始培養(yǎng)基 pH 為5.3，與最適pH接近，所以pH不用調(diào)節(jié)．

圖3 不同發(fā)酵初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of initial pH on production of fibrinolytic enzyme

2.1.6 無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

微生物在生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的過(guò)程中需要某些無(wú)機(jī)鹽和微量元素作為各種酶的激活劑或輔助因子，這些物質(zhì)一般在較低且合適的濃度下才對(duì)產(chǎn)酶起促進(jìn)作用，而在較高濃度下將會(huì)抑制產(chǎn)酶，因而很有必要研究常見(jiàn)無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響，且需要確定其最適濃度．

選擇 CaCl2、MnSO4、KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、NaCl、CuSO4、FeSO4進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察這些無(wú)機(jī)鹽對(duì)菊芋小孢根霉產(chǎn)生纖溶酶的促進(jìn)作用．加入量為10,mmol/kg，結(jié)果見(jiàn)表3．

表3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響Tab.3 Effect of inorganic salts on production of fibrinolytic enzyme

結(jié)果表明，MgSO4、(NH4)2SO4、FeSO4對(duì)產(chǎn)酶有很好的促進(jìn)作用，故選擇這3種無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定其最佳加入量．正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 4，通過(guò)分析可知，最優(yōu)無(wú)機(jī)鹽配比為 MgSO410,mmol/kg，(NH4)2,SO4200,mmol/kg，F(xiàn)eSO43,mmol/g；觀察R值，可知(NH4)2SO4對(duì)產(chǎn)酶影響最大．

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 ,Orthogonal experiment results

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

在以上實(shí)驗(yàn)確定的最佳培養(yǎng)基(麩皮與豆粕比例 2∶1、初始 pH,5.0、含水量(干基)1,mL/g、MgSO410,mmol/kg、(NH4)2,SO4200,mmol/kg、FeSO43,mmol/kg)條件下進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)．

2.2.1 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

向每克培養(yǎng)基中分別接入 2×106、6×106、107個(gè)孢子，測(cè)定酶活力的結(jié)果分別為(386.48±19.33)U/g、(468.34±23.42)U/g 和(349.58±17.48)U/g，表明接種量為 6×106,g-1時(shí)酶活力最高，為(468.34±23.41)U/g．

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

在以上最佳條件下，分別發(fā)酵 48、60、72、80,h，結(jié)果如圖4所示．結(jié)果表明：發(fā)酵時(shí)間達(dá)到72,h產(chǎn)酶量最大，為(588.54±29.42)U/g．

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of fermentation time on production of fibrinolytic enzyme

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

在以上最佳發(fā)酵條件下，將配好的發(fā)酵培養(yǎng)基分別放置在 24、29、33、37、42,℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵，72,h后分別測(cè)酶活力，結(jié)果如圖 5所示．結(jié)果表明：最佳發(fā)酵溫度為 29,℃，最高酶活力為(654.19±32.71)U/g．

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of temperature on production of fibrinolytic enzyme

2.2.4 培養(yǎng)基厚度對(duì)產(chǎn)酶的影響

在以上最佳條件下，配制厚度分別為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0,cm 的固態(tài)培養(yǎng)基，考察培養(yǎng)基厚度對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖 6所示．結(jié)果表明：當(dāng)培養(yǎng)基厚度為 2,cm 時(shí)產(chǎn)酶量最大，達(dá)到(668.76±33.38)U/g．

圖6 培養(yǎng)基厚度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of medium thickness on production of fibrinolytic enzyme

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在以上實(shí)驗(yàn)確定的最佳培養(yǎng)基(麩皮與豆粕比例2∶1，初始 pH,5.0，含水量(干基)1,mL/g，MgSO410,mmol/kg，(NH4)2SO4,200,mmol/kg，F(xiàn)eSO4,3,mmol/kg)及最適培養(yǎng)條件(接種量 6×106,g-1，培養(yǎng)基厚度2,cm，29,℃恒溫發(fā)酵 72,h)下發(fā)酵菊芋小孢根霉，測(cè)得平均酶活力為(684.39±34.22)U/g，是未優(yōu)化條件下產(chǎn)酶量的8.2倍．

3 結(jié) 論

菊芋小孢根霉最適發(fā)酵培養(yǎng)基配料組成及培養(yǎng)條件：麩皮與豆粕的比例為 2∶1；含水量(干基)為1,mL/g；初始pH,5.0，由于與原始pH接近，故不用調(diào)節(jié)；無(wú)機(jī)鹽加入量為 MgSO4,10,mmol/kg，(NH4)2SO4200,mmol/kg，F(xiàn)eSO43,mmol/kg，其中(NH4)2,SO4對(duì)產(chǎn)酶影響最大；孢子最佳接入量為 6×106,g-1，發(fā)酵時(shí)間為 72,h，發(fā)酵溫度 29,℃，培養(yǎng)基厚度 2,cm．在最佳條件產(chǎn)酶量大幅度提高，從開(kāi)始的(83.46±8.34)U/g提高到(684.39±34.22)U/g，效果顯著，為進(jìn)一步放大探索工業(yè)化產(chǎn)酶方法奠定了基礎(chǔ)．

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