速凍水餃細菌總數(shù)FISH檢測技術的優(yōu)化*

井洪珍，羅劍飛，林煒鐵，何慶

(華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州，510006)

隨著人們生活節(jié)奏的加快，速凍食品行業(yè)近年來也有了長足的發(fā)展，低溫儲存和運輸不僅延長了食品保質期，且最大限度地保持了食品的形狀，食用方便。但是人們對生活品質的要求越來越高，對食品安全尤為關注，食源性微生物引發(fā)的疾病已成為目前世界上最受關注的公共衛(wèi)生問題之一［1］。而速凍水餃為速凍食品中最主要的品種之一，與人們的生活息息相關?！八寄睢薄ⅰ叭焙汀盀匙写a頭”等國內速凍食品知名品牌相繼被檢出金黃色葡萄球菌后，使得速凍食品行業(yè)陷入“細菌門”。速凍水餃為帶餡食品，原材料中細菌超標和運輸過程中的溫度波動是導致細菌總數(shù)超標的兩大主要原因，其污染物控制較難。傳統(tǒng)國標法檢測細菌總數(shù)，操作流程繁瑣，耗時耗力，檢測周期長［2－3］，因此，探索簡便、靈敏度高、省時省力的快速檢測方法迫在眉睫。

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術，是利用熒光標記的寡核苷酸探針來檢測特定微生物的一種非放射性的分子遺傳學技術。它不需要破壞細胞形態(tài)，主要步驟有玻片的制備、細胞的固定、雜交、探針的洗脫和鏡檢，操作簡便、安全、檢測信號強、檢測周期短，5～8 h就可以得到結果。與傳統(tǒng)國標法相比簡便、快速、準確度高。在檢測致病菌中不依賴PCR，結合顯微鏡的可視性，可以獲得微生物的大小、形態(tài)及空間分布等信息，實現(xiàn)對微生物的定位、定量。但該技術對實驗條件要求高，且速凍水餃中成分復雜，面粉、膠質、油脂等都會影響實驗結果的準確性，因此樣品的預處理非常關鍵。本研究通過優(yōu)化FISH技術檢測速凍水餃中的細菌總數(shù)，從而構建快速檢測速凍水餃中微生物的FISH實驗流程，為提高食品安全提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗室保藏大腸桿菌菌種，市售芹菜豬肉、玉米蔬菜豬肉、韭菜豬肉、香菇雞肉4種餡料的速凍水餃。

1.1.1 寡核酸探針及所標記熒光素

根據(jù)細菌的16S rRNA序列選擇通用探針EUB338［4］，序列為 5，-3，GCTGCCTCCCGTAGGAGT，靶位點為16S rRNA 338－355，可以檢測大多數(shù)的細菌，是熒光原位雜交中最常用的探針，也可以檢測真菌。5，端用四甲基-6羧基羅丹明(TAMRA)標記，最大吸收波長為550 nm，最大發(fā)射波長為620 nm，呈橙紅色熒光，探針由生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 主要儀器及設備

BX51熒光生物顯微鏡(OLYMPUS);BS224S電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司);TDL-5000B飛鴿牌離心機(上海安亭科學儀器廠);Master-Q超純水制備儀(上海和泰儀器有限公司);BPG-9240A電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司);HH-S恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司);PB-10 PH計(北京賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.1.3 實驗用試劑的配制

雜交液配制［5］:SDS 0.01%(W/V)，Tris-HCl(pH 7.2)20 mmol/L，NaCl 900 mmol/L，去離子甲酰胺(DAF)濃度由實驗確定，pH7.2。

洗脫液配制［5］:Tris-HCl(pH7.2)20 mmol/L ，SDS 0.01%(W/V)，EDTA 5 mmol/L，NaCl濃度由正交試驗確定，用去離子水定容至100 mL，最后用1 mol/lHCl調pH值至7.2。

4%多聚甲醛(Pareforaldehyde)的配制:稱取40 g多聚甲醛溶于裝有500 mL ddH2O的燒杯中，持續(xù)加熱磁力攪拌至60℃，使成乳白色懸液。用1.0 mol/L的NaOH調pH值至7.0，使呈清亮狀，再加入約100 mL 10×PBS，充分混勻(在冰浴或冷水浴中)，保證pH7.0，過濾后定容至1 000 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PBS緩沖液(pH 7.4):NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO44.3 mmol/L，KH2PO41.4 mmol/L，稱 7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4(or 1.44g Na2HPO4)和1.8g K2HPO4，溶于800 mL蒸餾水中，用HCl調節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1 L，保存于4℃冰箱中即可。

1.2 實驗方法

1.2.1 玻片處理

玻片清洗 熱肥皂水浸泡并清洗玻片，然后用蒸餾水沖洗3～5次，浸泡在1%的HCl中24 h，備用。

硅化處理:將玻片浸沒在質量分數(shù)1%的HCl中煮沸10 min，撈出并置于蒸餾水中1 min，然后用蒸餾水沖洗3次，50℃烘干1 h，錫紙包好，4℃保存即可。

明膠涂片:稱取0.1g明膠溶于50～80 mL蒸餾水中，加熱攪拌，溶解后，稀釋至100 mL，保持60℃，將烘干的玻片放入明膠中浸泡10 min，60℃烘干備用。

1.2.2 取樣及預處理

1.2.2.1 取樣

本實驗中的大腸桿菌菌種為實驗室保藏菌種，挑取大腸桿菌菌落接種于LB液體培養(yǎng)基內，37℃活化培養(yǎng)24 h，適量菌液涂布于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后挑取單菌落于加有1 mL PBS緩沖液的離心管中，制成菌懸液，備用。

水餃樣品采購后1 h內放進冰箱，實驗前解凍，解凍時45℃以下不超過15 min［6］，按照GB 4789.1－2010采樣標準采樣。取20 g樣品，研磨，加入裝有35 mL的滅菌生理鹽水中(8.5%)，加入適量玻璃珠，置37℃搖床中30 min，用4層紗布過濾，得到菌懸液，分裝于2 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，移去上清，加入1 mL的PBS(pH7.4)緩沖液，重新懸浮，12 000 r/min離心5 min，重復3次，直至液體澄清。

用油性筆在處理好的玻片上分別標出邊長為1.5 cm的正方形區(qū)域，并取10 μL分散好的菌液均勻涂于玻片上。

1.2.2.2 樣品的熱固定

熱固定溫度為46℃，熱固定時間為1～3 h，具體時間由實驗確定。

1.2.2.3 4%多聚甲醛固定

熱固定后，用 4%多聚甲醛(pareforaldehyde，PFA)于4℃條件下固定10～20 min，具體時間由實驗確定。用PBS緩沖液洗脫3次，自然風干。

1.2.2.4 細胞的通透性處理

樣品固定后，加入25μL的溶菌酶，37℃，10 min，用無菌超純水將殘余的溶菌酶溶液清洗掉，依次在50%，80%，98%的乙醇溶液脫水，脫水時間由正交試驗確定。

然后加入 20 μL 的蛋白酶 K，37℃，10 min，用無菌超純水洗脫，依次在50%，80%，98%的乙醇溶液中脫水，室溫干燥。

1.2.3 原位雜交

在密閉雜交盒中放入吸水紙，適量雜交液濕潤.在固定菌體的區(qū)域內加入雜交液19 μL、EUB338探針1 μL，放入不透光的濕潤雜交盒內，46℃下雜交2～4 h，為保持雜交盒濕潤，可置于46℃密閉水浴鍋中預熱，探針質量濃度為100 ng/μL，雜交溫度和雜交時間由正交試驗確定。

1.2.4 探針的洗脫

雜交完畢，取出載玻片，放入48℃雜交洗脫液(洗脫鹽濃度由正交試驗確定)中洗脫15 min，無菌超純水漂洗3次 ，自然風干，避光。

1.2.5 鏡檢與計數(shù)

制好的玻片用甘油/PBS緩沖液(pH8.5，體積比為9∶1)封片［7］。然后置于熒光顯微鏡下鏡檢并計數(shù)。

將玻片置于OLYMPUS BX51型熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光經(jīng)過3號濾光片，即綠色激發(fā)光，陽性結果顯示為橙色熒光;目鏡放大倍數(shù)為10，物鏡放大倍數(shù)Mob為40，視場數(shù)FN為22。每張玻片觀察10個視野，拍照保存。每個視野拍攝2張照片，一張是在激發(fā)光下的熒光照片，另一張為在普通光源下的普通照片。用IPP(Image-Pro Plus)軟件對照片進行分析和計數(shù)。細菌濃度為E(cells/mL):

其中:N為樣品的稀釋倍數(shù);A為視野中熒光細胞平均數(shù);S1為樣品涂抹的面積(mm2);S2為視野面積(mm2);視場直徑F=FN/Mob=22/40=0.55 mm;視野面積S2=π(F/2)2;V為樣品體積(mL)。

1.2.6 對照試驗

為避免實驗結果出現(xiàn)假陽性，需設置陰性對照和陽性對照［5］:陰性對照不加探針，其他處理均相同;陽性對照不加樣品。

1.3 FISH實驗條件優(yōu)化

1.3.1 玻片處理

分別比較硅化和包埋對FISH的影響，得到最佳的處理方法。

1.3.2 細胞固定

分別比較46℃熱固定、4%多聚甲醛固定和熱固定+多聚甲醛固定3種固定方法對FISH的影響，得到最佳的細胞固定方法。

1.3.3 去離子甲酰胺濃度

分別比較20%，30%，40%的甲酰胺濃度對FISH的影響，得到最佳的去離子甲酰胺處理濃度。

1.3.4 預處理正交試驗優(yōu)化

根據(jù)上述比較試驗結果，選取合適的玻片處理方法、細胞固定方法和去離子甲酰胺濃度處理樣品，對預處理過程中熱固定時間、乙醇脫水時間和多聚甲醛固定時間進行正交試驗優(yōu)化，根據(jù)文獻常用水平，設置各因素水平見表1。

表1 預處理正交試驗因素水平Table 1 the level of orthogonal factors

1.3.5 雜交實驗條件優(yōu)化

從樣品的預處理正交試驗結果出發(fā)，對雜交實驗條件進行優(yōu)化。根據(jù)文獻中常用各因素水平，設置正交試驗各因素水平見表2。

表2 雜交條件正交試驗因素水平Table 2 the level of orthogonal factors

2 結果與討論

2.1 硅化與明膠包埋結果比較

由玻片硅化處理和明膠包埋效果圖(圖1)比較可知，對于同一樣品，明膠包埋效果明顯優(yōu)于硅化處理的玻片，硅化處理的玻片，細胞流失較多，不利于細胞的附著，而明膠包埋的玻片，由于明膠的粘附作用，可以很好地結合細胞，在雜交和探針清洗過程中減少細胞流失，從而保證雜交的充分性。

圖1 玻片不同處理方式與熒光信號之間的關系(400)Fig.1 The relationship between slide of different approach and flurescence signal(400)

2.2 不同固定方式對實驗結果的影響

通過比較3種固定方法可知，樣品熱固定后再用4%多聚甲醛固定雜交效果最好(圖2);雖然4%多聚甲醛能夠較好的保持細胞形態(tài)，但單獨用其中的一種方法來固定細胞，丟失較嚴重，從而影響雜交效果，所以采用熱固定和多聚甲醛固定結合的方法對樣品中微生物細胞進行固定。

2.3 不同甲酰胺濃度比較

通過比較觀察圖片(圖3)可知，雜交液中含有20%去離子甲酰胺的雜交信號較強，并且雜交比較充分，去離子甲酰胺濃度為30%時，雜交信號弱，細菌熒光數(shù)少，當濃度增加到40%時，雜交信號模糊，雜交不完全，特異性差。

2.4 不同洗脫鹽濃度比較

雜交試驗中，樣品的洗脫效果主要受洗脫液中NaCl濃度的影響，本實驗分別比較了NaCl濃度為60 mmol/L、145 mmol/L、和225 mmol/L時的雜交效果，如圖4所示，可以看出C(NaCl)為60 mmol/L時，洗脫不充分，背景出現(xiàn)粘連，模糊不清;NaCl濃度為225 mmol/L時的雜交信號比較強，背景干擾較少。

圖2 不同的固定方式與熒光信號之間的關系(400)Fig.2 The relationship between the different fixed slides and fluorescence signal(400)

圖3 不同甲酰胺濃度與熒光信號之間的關系(400)Fig.3 The relationship between formamide concentration and fluorescence signal(400)

圖4 洗脫鹽濃度與熒光信號之間的關系(400)Fig.4 the relationship between salt concentration and fluorescence signal(400)

2.5 不同雜交溫度比較

實驗分別比較了雜交溫度為42、46、50℃時的雜交效果，其他處理均相同，由圖片比較可知雜交溫度為46℃時，雜交最為充分、信號強度也較亮，50℃時，出現(xiàn)假陽性。

2.6 雜交時間不同

由雜交得到的圖片(圖6)可知，雜交時間3h時效果最佳，雜交比較充分，檢測信號強。雜交時間太短，檢測得到的雜交信號較弱，雜交率也比較低;雜交時間過長，則非特異性雜交會增多，從而影響實驗結果的準確性。

2.7 樣品預處理條件的正交優(yōu)化

對樣品的熱固定時間、乙醇脫水時間和多聚甲醛固定時間設計3因素、3水平的正交表L9(34)，每組設2個平行，并設置陰性和陽性對照，鏡檢，拍照并記錄單個視野中的熒光細胞數(shù)P，實驗結果見表3。

圖5 雜交溫度與熒光信號之間的關系(400)Fig.5 The relationship between the hybridization temperature and the fluorescence signal(400)

圖6 雜交時間與熒光信號之間的關系(400)Fig.6 The relationship between hybridization time and the fluorescence signal(400)

表3 預處理條件正交試驗結果Table 3 The pretreatment orthogonal test results

由正交試驗和極差分析結果可知，預處理各因素對熒光原位雜交效果影響大小順序為:Ca(4%多聚甲醛固定時間)＞Aa(熱固定時間)＞Ba(乙醇脫水時間)，即4%多聚甲醛的固定時間對實驗結果影響最大，其次是熱固定時間，乙醇脫水時間對結果影響較小。各因素對應的K值中的最大值所對應的水平，即為該因素最優(yōu)水平。從表中可知，Aa因素對應的最優(yōu)水平為2，Ba因素對應的最優(yōu)水平為3，Ca因素對應的最優(yōu)水平為3，即預處理條件的最優(yōu)組合為:46℃熱固定2 h，系列梯度乙醇脫水5 min，4%多聚甲醛固定20 min。

2.8 雜交條件的正交試驗優(yōu)化結果

熒光原位雜交試驗中，雜交溫度高于50℃，會出現(xiàn)雜交信號減弱和非特異性結合增多等問題［8］，因此本實驗對雜交溫度、雜交時間和洗脫鹽濃度設計3因素、3水平的正交表，用單個視野中的熒光細胞數(shù)(Y)與普通光源下的細胞數(shù)(K)的比值(Y.K－1)作為依據(jù)，其中Y.K－1越接近1，表示雜交越充分，雜交率越高。通過極差分析來得到雜交條件的最優(yōu)組合，其正交實驗結果見表4。

由正交試驗和極差分析結果可知，Ab(雜交溫度)＞Cb(洗脫鹽濃度)＞Bb(雜交時間)，即雜交各因素中，雜交溫度對雜交實驗結果影響最大，其次是洗脫鹽中NaCl濃度，雜交時間也有一定的影響，各因素對應的最大K值所對應的水平，即為該因素最優(yōu)水平。由表中可知，Ab因素對應的最優(yōu)水平為2，即雜交溫度為46℃;Bb因素對應的最優(yōu)水平為2，即雜交時間為3 h;Cb因素對應的最優(yōu)水平為3，即洗脫鹽中NaCl濃度為225 mmol/L。因此，樣品雜交條件的最優(yōu)組合為:雜交溫度46℃，雜交時間3 h，洗脫鹽濃度為225 mmol/L。

表4 雜交條件正交試驗結果Table 4 The Hybridization Orthogonal test results

2.9 水餃樣品檢測結果

由上述優(yōu)化方案可知，最優(yōu)雜交試驗條件為熱固定3 h，多聚甲醛固定20 min，乙醇脫水5 min，雜交溫度46℃，雜交時間3 h，最后用C(NaCl)=225 mmol/L的洗脫液洗去多余探針。按照上述優(yōu)化方案檢測4種速凍水餃，每種隨機取2個樣檢測，并設置陰性和陽性對照，F(xiàn)ISH檢測結果如圖7所示，菌體分散均勻，檢測熒光信號強，計數(shù)統(tǒng)計結果如表5所示。

從表5可以看出，隨機抽樣檢測的樣品中細菌總數(shù)在106cells/g左右，而速凍水餃中的細菌總數(shù)在103～106CFU/g水平之間［9］，研究結果與之相符，且細菌總數(shù)含量都較高，所檢測的8個樣品中有2個樣品細菌總數(shù)超標，加強食品安全迫在眉睫。

圖7 水餃樣品檢測結果(1000)Fig.7 The dumplings samples test results(1000)

表5 FISH檢測樣品細菌總數(shù)結果Table 5 The results of total bacteria by FISH

3 結論

利用FISH技術檢測速凍水餃中細菌總數(shù)，水餃樣品的預處理是其中的一個難題，針對速凍水餃中的各不同成分，加入玻璃珠振蕩、離心、過濾，可以很好地使菌體與雜質分離，去除多余的膠質及其他雜質;PBS緩沖液不僅能夠洗去多余油脂，制成菌懸液，還可以使細胞充分擴散;適量的溶菌酶處理，可以溶解膜脂和蛋白質，增大細胞膜的通透性，從而促使探針進入細胞;適當濃度的蛋白酶處理，可以溶解多余的蛋白質，促進探針進入細胞核，且不會破壞細胞形態(tài)。另外，系列濃度乙醇脫水和SDS都可以除雜并增大細胞膜的通透性;這些問題的解決為之后的雜交奠定了基礎。由于雜交液中添加了質量濃度為20%的甲酰胺，降低了雜交溫度，在46℃雜交可以避免樣品與探針的非特異性結合，控制雜交時間可以降低假陽性，提高實驗結果的準確性。

熒光原位雜交中，采用人工合成的寡聚核苷酸作為探針，具有特異性好、易獲得和成本低的特點［10］，為研究和應用提供了充分的條件，熒光原位雜交與其他方法相比具有簡便、快捷、特異性強的優(yōu)點［11］。優(yōu)化利用FISH方法檢測速凍水餃中的細菌總數(shù)，與傳統(tǒng)的國標檢測方法相比，具有簡便、快捷、靈敏度高的特點，與流式細胞術(FCM)結合可以定量檢測廢水中的微生物［12］，為食品中微生物的快速檢測奠定了基礎。

針對速凍水餃行業(yè)，要把微生物控制在低水平范圍內還存在很大的困難，目前市場上存在的不規(guī)范的儲運，使得食品安全受到嚴重威脅。速凍水餃餡料中的肉類由于原料營養(yǎng)豐富，是微生物污染的重要誘因，同時溫度波動也是影響其品質的又一因素。保障食品安全，不僅要從原材料抓起，其輸送條件的控制也很重要，要嚴格控制溫度，使運輸和保藏過程中溫度波動不超過2℃。另外，工廠的生產(chǎn)工藝條件，生產(chǎn)設備及環(huán)境也會影響速凍水餃中的微生物含量，保障食品安全仍需努力。

［1］ Malorny B.Standardization of diagnostic PCR for the detection of foodborne pathogens［J］.Int J Food Microbiol，2003，83(1):39 －48.

［2］ 唐漪靈，郭奕芳.Petrifllm紙片法和國際法檢測奶制品細菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)的結果比較［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2000，10(3):325－327.

［3］ 吳清平，周艷紅，蔡芷荷.衛(wèi)生微生物特異性顯色培養(yǎng)基的研究與應用［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，15(1):124－126.

［4］ Amann R I.Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations［J］.Appl Environ Microbiol，1990，56(6):1 919－1 925.

［5］ Lorenzen J.Biosensor determination of the microscale distribution of nitrate，nitrate assimilation，nitrification，and denitrification in a diatom-inhabited freshwater sediment［J］.Appl Environ Microbiol，1998，64(9):3 264 －3 269.

［6］ GB 4789.1－2010食品安全國家標準 食品微生物學檢驗總則［S］.

［7］ 龔春明.應用FISH技術對土壤中大腸桿菌的快速特異性檢出［J］.海峽科學，2009，17(3):26－28.

［8］ Roller C.In situ probing of gram-positive bacteria with high DNA G+C content using 23S rRNA-targeted oligonucleotides.Microbiology［J］，1994，140(Pt 10):2 849－2 858.

［9］ 史艷宇，劉金華，華蕾，等.速凍水餃中主要微生物學指標調查研［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18(12):2 741－2 742.

［10］ 陳瑛.微生物熒光原位雜交 (FISH)實驗技術［J］.哈爾濱工業(yè)大學學報，2008，40(4):546－549.

［11］ Yuregir O O.Fluorescent in situ hybridization studies in multiple myeloma［J］.Hematology，2009，14(2):90 －94.

［12］ 張燕燕，陳進軍.FISH-FCM方法檢測酵母-細菌二元體系中微生物數(shù)量［J］.生態(tài)學報，2008，28(10):4 849－4 855.