海洋低溫β-半乳糖苷酶菌株篩選、鑒定及酶的分離純化

崔愛萍，遲乃玉，張慶芳

1(大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連，116622)2(遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連，116622)

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)常簡稱為乳糖酶，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中。此酶最初主要應(yīng)用于乳品工業(yè)中將轉(zhuǎn)化乳糖為單糖，生產(chǎn)低乳糖奶，以緩解乳糖不耐癥［1］。目前可以用于制備低聚半乳糖，在食品工業(yè)用于飲料、冰淇淋、糖果、奶粉、口服液等［2－4］，還可以作為腸道內(nèi)雙歧桿菌的增殖因子［5－7］，有效提高人體各項(xiàng)機(jī)能。

在低溫條件下，低溫酶仍具有較高酶活，相較中高溫酶該低溫酶制劑可以降低生產(chǎn)成本，減少工藝流程，提高生產(chǎn)效率，增加經(jīng)濟(jì)效益，改善產(chǎn)品質(zhì)量。低溫β-半乳糖苷酶大多是由低溫微生物產(chǎn)生，它們主要分布在極端環(huán)境中并經(jīng)過長期馴化。目前已經(jīng)從南極［8－12］、日本北海道［13］等地分離到產(chǎn)低溫 β-半乳糖苷酶的菌株，研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)低溫β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌為假交替單胞菌和節(jié)桿菌屬的菌株。篩選得到的菌株為土生拉烏爾菌，目前還未見有關(guān)該菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品由國家海洋環(huán)境檢測中心采自黃海海域123.396°E，36.701 4°N，深度 6 ～50 m 海泥。

ONPG(鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷)、x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷)購自上海生工，其余均為國產(chǎn)分析純。

富集培養(yǎng)基:乳糖 20 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1 L，pH 7.0;1 ×105Pa，121℃滅菌30 min。

平板篩選培養(yǎng)基:乳糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 L，pH7.0;1 ×105Pa，121℃滅菌30 min，暗處涂布濃度為20 mg/mL的 x-gal溶液［14］。

平板活化培養(yǎng)基:乳糖20 g，蛋白胨10 g，NaCl g，蒸餾水1 L，pH 7.0;1 ×105Pa，121℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基:乳糖20 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1L，pH 7.0;1 ×105Pa，121℃滅菌 30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:乳糖20 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1L，pH 7.0;1 ×105Pa，121℃滅菌 30 min。

菌種保藏培養(yǎng)基:牛肉膏20 g，酵母膏10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1L，pH 7.0;1 ×105Pa，121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1200型紫外可見分光光度計(jì)(配有寬波長高精度AD轉(zhuǎn)換器)，上海美譜達(dá)儀器有限公司;JY98-3D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(配有不同功率變幅操作系統(tǒng))，寧波新芝生物科技有限公司;HD-4電腦核酸蛋白檢測儀(配有254、280 nm數(shù)顯和80 μL數(shù)顯)，上海滬西分析儀器有限公司;CBS-B程控多功能自動(dòng)部份收集器(配有微處理器控制和多容量收集裝置)，上海滬西分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選

10 g海泥，90 mL無菌水，加入乳糖作為唯一碳源，20℃低溫振蕩培養(yǎng)30 h，無菌水對(duì)富集上清液進(jìn)行梯度稀釋，均勻涂布到含有x-gal的平板篩選培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)30 h。挑取顯藍(lán)色菌落(如無藍(lán)色顯示，4℃隔夜放置)，在無x-gal的平板篩選培養(yǎng)基繼續(xù)劃線純化，分別挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基20℃振蕩培養(yǎng)30 h，測定β-半乳糖苷酶活性并篩選酶活最高的菌株。

1.3.2 β-半乳糖苷酶粗酶液的制備

取發(fā)酵液4℃離心(6 000 r/min)30 min，pH7.0磷酸緩沖液沖洗，離心，重復(fù)2次，離心，加pH7.0磷酸緩沖液至與發(fā)酵液相同體積，冰水浴超聲處理(500 W，工作 1 s，間歇2 s，10 min)，4℃離心(8 000 r/min)30 min，得到上清液，即為β-半乳糖苷酶粗酶液。

1.3.3 β-半乳糖苷酶酶活測定方法

β-半乳糖苷酶粗酶液用pH 7.0磷酸緩沖液適當(dāng)稀釋，取0.5 mL稀釋粗酶液加入1.5 mL0.25%鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(oNPG)，25℃反應(yīng)10 min，加入2 mL.1 mol/L NaCO3終止反應(yīng)。測420 nm處吸光值，計(jì)算酶活力。對(duì)照組為加入oNPG和NaCO3，最后加粗酶液。

酶活力定義:按照β-半乳糖苷酶酶活力測定方法，每分鐘分解ONPG生成1 μmol oNP的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。

1.3.4 菌種鑒定方法

1.3.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

在平板培養(yǎng)基上觀察菌落形狀、顏色、大小等形態(tài)學(xué)特征，通過不同染色方法在光學(xué)顯微鏡(10×100)下觀察菌體形態(tài)。

1.3.4.2 生理生化鑒定方法

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》(2001年)相關(guān)內(nèi)容，對(duì)該菌種進(jìn)行苯丙氨酸脫氫實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)、乳糖水解實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、尿素水解實(shí)驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)。

1.3.4.3 分子生物學(xué)鑒定方法

采用酚氯仿抽提法提取菌株DNA。應(yīng)用16S rDNA兩端保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物:Forward primer P1(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)和 Revese primer P2(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系 Ex Taq(5 U/μL)0.25 μL，Buffer 5.0 μL，dNTP mixture 5.0 μL，P1 primer 1.0 μL，P2 primer 1.0 μL，補(bǔ)加 ddH2O 至 50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán);94℃變性1 min，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min，1個(gè)循環(huán)。PCR得到的擴(kuò)增產(chǎn)物送交大連寶生物工程有限公司測序。得到含有1 492 bp的16S rDNA核苷酸序列，登陸NCBI，輸入GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對(duì)，獲取與其核酸序列相似度高的菌種。采用MEGA5軟件進(jìn)行多序列匹配比對(duì)，計(jì)算相近序列之間的進(jìn)化距離，利用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 酶分離純化

1.3.5.1 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀

在粗酶液中加入飽和度為10%～80%的(NH4)2SO4溶液，4℃鹽析12 h，蛋白沉淀用 pH 7.0磷酸緩沖液溶解，分別測定每個(gè)梯度鹽析得到的沉淀酶活，最后收集含有酶活性的蛋白沉淀溶解進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5.2 透析和超濾

(NH4)2SO4沉淀溶解得到的酶液裝入預(yù)先處理好的透析袋中，4℃透析，用硝酸鹽溶液檢測透析袋外液無沉淀產(chǎn)生除去NaCl，并同時(shí)除去小分子物質(zhì)和金屬離子。將透析完成的樣品轉(zhuǎn)入截留分子量為10 kDa，經(jīng)過預(yù)處理的超濾管超濾，4℃，5 000 r/min離心30 min，移液槍小心取出濃縮液，4℃保藏備用，取部分溶于磷酸緩沖液，計(jì)算回收率。

1.3.5.3 Sephadex-G100柱層析

利用具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒的分子篩作用，根據(jù)分離樣品中分子質(zhì)量大小的差異進(jìn)行洗脫分離的一項(xiàng)技術(shù)。按照分子在層析凝膠中的保留時(shí)間長短逐步洗脫。

取5 mL超濾后酶液加入預(yù)先用pH 7.0磷酸緩沖液平衡過的Sephadex G100凝膠柱(φ1.6 cm×50 cm)，調(diào)節(jié)恒流泵洗脫速度控制在0.3 mL/min。調(diào)節(jié)自動(dòng)收集器，每管收集3 mL，根據(jù)顯示器的洗脫峰記錄試管號(hào)，分別測定每管酶活。

1.3.5.4 SDS-PAGE電泳

采用SDS-PAGE鑒定酶的純化程度，用考馬斯亮藍(lán)染色法確定電泳條帶的位置。SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物長度與其分子量成正比，電泳遷移率主要取決于分子量的大小。電泳結(jié)束后，染色、脫色，若得到單一條帶，即為純化的β-半乳糖苷酶。

電泳指標(biāo):分離膠12%，濃縮膠5%，電壓100 V，1.5 mm梳，時(shí)間2 h，考馬斯亮藍(lán)R250染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

平板分離純化得到7株能分解x-gal使菌落顯藍(lán)色的菌株。由菌落表面特征初步判斷均為細(xì)菌，分別命名CD1～CD7。

對(duì)CD1～CD7分別進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵20℃30 h，利用β-半乳糖苷酶酶活測定方法分別測定7菌株的酶活，篩選酶活最高的菌株CD6作為實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌種。酶活結(jié)果見表1。

表1 菌株酶活比較Table 1 Enzymatic activity comparison of different strains

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

由圖1、圖2可知，菌株CD6在平板培養(yǎng)基上菌落為圓形，邊緣整齊，乳白色，表面光滑，濕潤，半透明，鼻涕狀，黏稠，在培養(yǎng)基上易成片存在，用接種環(huán)易挑取。鏡檢革蘭氏染色陰性，桿狀，末端鈍圓，有莢膜無芽孢。

圖1 菌株CD6菌落形態(tài)圖Fig.1 The colony morphology of strain CD6

圖2 菌株CD6顯微形態(tài)特征Fig.2 The micro-morphology of strain CD6

2.2.2 生理生化特征

按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》(2001)關(guān)于革蘭氏陰性桿菌的相關(guān)檢索內(nèi)容，對(duì)菌株CD6的生理生化特征進(jìn)行檢驗(yàn)和測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 菌株CD6生理生化特征Table 2 Traditional taxonomical properties of strain CD6

2.2.3 菌株16S rDNA鑒定

進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過測序得到CD6菌株16S rDNA全序列，長1 492bp，其序列如下:

5'-AATTTCACACAGGAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGAGGAGGAAGGCGATAAGGTTAATAACCTTAGTGATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGG-3'

將所得序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，Raoultella terrigena(NR 037085.1)與CD6相似性達(dá)到99.59%。由上述形態(tài)學(xué)及生理生化特征實(shí)驗(yàn)將CD6初步確定為Raoultella terrigena。采用MEGA5軟件計(jì)算相似序列之間的系統(tǒng)進(jìn)化距離并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果表明二者同源性可靠程度為95%，可以確定菌株 CD6為 Raoultella terrigena。如圖該菌種屬于拉烏爾菌屬，通過核酸測序、生理生化及DNA雜交技術(shù)于2001年建立的新屬。

圖3 菌株CD6系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree showing the relationships of CD6 with the sequence of relating type

2.3 酶分離純化

粗酶液經(jīng)(NH4)2SO4鹽析得到的蛋白沉淀均無活性，說明(NH4)2SO4分級(jí)沉淀對(duì)該酶影響很大，因此粗酶液直接進(jìn)行透析、超濾除雜濃縮。濃縮液經(jīng)Sephadex G100凝膠柱層析，結(jié)果如圖4所示。在整個(gè)洗脫過程共出現(xiàn)3個(gè)峰，分別測定各管酶活，發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶主要集中在第1個(gè)蛋白峰內(nèi)。說明經(jīng)過Sephadex G100凝膠柱層析除去了一部分小于其分子量的蛋白。

圖4 Sephadex-G100凝膠柱層析洗脫結(jié)果Fig.4 The eluting result of sephadex-G100 column chromatography

粗酶液經(jīng)過透析、超濾、Sephadex-G100層析處理后，由圖可知，低溫 β-半乳糖苷酶回收率達(dá)到了33.77%，比活力提高了近4倍。

2.4 SDS-PAGE電泳結(jié)果

經(jīng)過每一步分離純化處理的酶液進(jìn)行SDSPAGE電泳，得到的電泳結(jié)果如圖5所示。粗酶液經(jīng)過透析、超濾、Sephadex-G100層析處理后電泳得到了單一條帶，說明純化效果較好。根據(jù)相對(duì)遷移率分子量的關(guān)系，可以計(jì)算出該低溫β-半乳糖苷酶的分子量為30.8 kDa。

表3 低溫β-半乳糖苷酶純化結(jié)果Table 3 The result of isolation and purification

圖5 酶液SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE of enzyme solution at different stages of purification

2.5 酶最適溫度確定

由圖6可知，酶的最適作用溫度為20℃;30℃剩余相對(duì)酶活85%;超過35℃酶活力即迅速下降。

圖6 反應(yīng)溫度對(duì)酶活的影響Fig.6 The effect of temperature on relative activity

3 結(jié)論

低溫微生物多來自極端低溫環(huán)境，但其產(chǎn)酶不一定為低溫酶。本文篩選的菌株CD6來自渤海海泥，經(jīng)鑒定為土生拉烏爾菌，目前沒有關(guān)于利用該菌生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的報(bào)道。經(jīng)過透析、超濾、Sephadex-G100層析處理就可以完成低溫β-半乳糖苷酶的分離純化，分子量30.8kDa，純化效果良好。批次生產(chǎn)低乳糖制品多是在10℃以下完成乳糖水解，菌株CD6低溫條件下生長良好，產(chǎn)β-半乳糖苷酶的最適溫度為20℃，10℃下相對(duì)酶活39%，可用于低乳糖奶制品生產(chǎn)。

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