去纖維蛋白核苷酸的分離與活性的初步測(cè)定

李 鵬

去纖維蛋白核苷酸的分離與活性的初步測(cè)定

李 鵬

本實(shí)驗(yàn)以豬肺為原料制備分離去纖維蛋白核苷酸，采用定磷法測(cè)定其含量，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考察了它在體內(nèi)、外的抗凝活性。

去纖維蛋白核苷酸；活性；作用

去纖維蛋白核苷酸是一種多聚脫氧核糖核酸鹽。1981年被評(píng)定為Defibrotieie（簡(jiǎn)稱DEF）。七十年代，意大利學(xué)者[1]Niada.R等發(fā)現(xiàn)DEF纖溶作用機(jī)理是DEF通過(guò)促進(jìn)血管壁產(chǎn)生和釋放組織纖溶酶原激活物（t-Pa）發(fā)揮效應(yīng)。近年，Niada.R又發(fā)現(xiàn)其具有抗血栓作用。經(jīng)過(guò)人們大量的研究工作發(fā)現(xiàn)了DEF除此之外還具有抗局部缺血、抗粥樣硬化等作用。

1 材料與方法

1.1 材料豬肺。試劑：0.1M Nacl+檸檬酸鈉0.05M混合液。氯仿：異戊醇（24：1 v/v）（沈陽(yáng)試劑一廠）。分析純KH2PO4（北京化工廠）。牛血清白蛋白（上海醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所）。定磷試劑、試劑甲、試劑乙（自行配制）。儀器：組織攪拌機(jī)、DS-1組織勻漿機(jī)、20PR-5冷凍離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)等。動(dòng)物：小白鼠18～20g、兔子。

1.2 制備方法[2]豬肺細(xì)胞核沉淀DNP沉淀水相(DNA鈉鹽)。①加適量混合液、搗碎、勻漿、離心、收集細(xì)胞核；②用1.71M Nacl提取DNP；③注入蒸餾水中，有沉淀、離心、收集DNP；④用1.71M Nacl溶解、離心加適量氯仿-異戊醇除蛋白；⑤離心、收集水相；⑥注入無(wú)水乙醇，脫水，干燥得白色固體。

1.3 含量測(cè)定方法[2-3]

1.3.1 定磷法

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備①配制標(biāo)準(zhǔn)磷溶液：稱取分析純KH2PO40.2195g，加蒸餾水至50ml，稀釋100倍，濃度為10ug/ml。②定磷試劑：3M H2SO4：H2O：2.5%鉬酸銨：10%抗壞血酸=1：2：1：1。③制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：按照下表1取樣及試劑補(bǔ)加水至1.0ml，各加定P試劑3ml，立即搖勻。

表1 定磷法取樣標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1.2 測(cè)定總磷量取消化后樣品，如前法測(cè)Aλ660。

1.3.1.3 測(cè)定無(wú)機(jī)磷量取未消化樣品，如前法測(cè)Aλ660。

1.3.1.4 核酸含量計(jì)算DNA中含磷量9.2%，根據(jù)磷量知DNA量。

1.3.2 Lowry法

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備①配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：精密稱取牛血清白蛋白50mg，用水定容至100ml，終濃度為0.5mg/ml；②制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：按照下表2加入試劑樣品。加水至1.0ml，各加試劑甲5ml，室溫；加試劑乙0.5ml，37℃水浴15’測(cè)Aλ550，作A-c圖。

表2 測(cè)量Aλ550值的取樣標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2.2 測(cè)定未知樣品方法同前

1.4 抗凝活性測(cè)定方法[4-5]

1.4.1 體外活性測(cè)定樣品液為將DNA溶于3ml 0.05M NaOH+7ml生理鹽水；對(duì)照液為3ml 0.05M NaOH+7ml生理鹽水。取一白瓷板，用滴管各加1滴樣品液和對(duì)照液，各做三份，晃動(dòng)瓷板，使液體均勻涂于凹槽內(nèi)，然后從兔耳打孔，讓血流出，滴于瓷板。各凹槽內(nèi)各加2滴兔血，記時(shí)。此后每隔20s用針頭挑一次血。每隔1min，傾斜白瓷板，直至垂直白瓷板而血液不流出記時(shí)T2，比較空白液和對(duì)照液的結(jié)果，測(cè)定各批樣品的凝血時(shí)間，并且用第二批樣品配成各種濃度，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以求得具有抗凝活性的最低濃度。

1.4.2 體內(nèi)測(cè)定法[6]取小白鼠12只分兩組，用靜脈注射，空白組注射生理鹽水，對(duì)照組注射DNA鈉水溶液各加0.2ml，一批為注射兩只，一個(gè)為空白，一個(gè)為對(duì)照。用藥10min后用放血法，每只小鼠取三份血樣，一份為3滴，然后同體外法測(cè)凝血時(shí)間，對(duì)比空白和樣品。

2 結(jié)果

2.1 各批DNA鈉鹽制品產(chǎn)量及收率見(jiàn)表3。

表3 各批次DNA鈉鹽制品產(chǎn)量及收率值

由于提純方法逐漸成熟，樣品顏色有改觀；以后各次產(chǎn)量收率接近，平均收率為1%左右。

2.2 定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表4。

表4 定磷法得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線值

第一次回歸方程r=0.985分析原因?yàn)槎坎粶?zhǔn)確，經(jīng)改正后得到第二次標(biāo)準(zhǔn)曲線，r=0.9999符合要求，故選擇此方程作為定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 以牛血清蛋白為基準(zhǔn)物，Lowry法制備蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表5。

表5 Lowry法得出的蛋白標(biāo)準(zhǔn)值

兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，第一次得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)及縱截距更接近于原點(diǎn)，為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 各批次制品百分含量測(cè)定值與測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6、7。

表6 各批次含量測(cè)定值

表7 各批次含量測(cè)定結(jié)果

第一批收率不高，總體純度近70%，剩余部分含有少量糖類(lèi)及脂類(lèi)未分離。

2.5 體外活性測(cè)定見(jiàn)表8。

表8 體外活性測(cè)定值

從表中可以看出，DNA鈉鹽制品有明顯的延長(zhǎng)凝血時(shí)間的活性，其在血液中最低抗凝濃度近似為150ng/ml。

2.6 體內(nèi)活性測(cè)定見(jiàn)表9。

表9 體內(nèi)活性測(cè)定值

結(jié)果表明體內(nèi)也具有抗凝活性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用材料為豬肺與以往采用的牛肺相比較，平均收率相近（1%），但豬肺提取的DNA鈉鹽總體純度（70%）稍低于牛肺（80%）。盡管豬肺提取的去纖維核苷酸純度偏低，在抗凝活性卻較高，可見(jiàn)在制備去纖維核苷酸時(shí)，不僅要注意純度，而且注意活性降低因素。本實(shí)驗(yàn)對(duì)于去纖維核苷酸的制備、含量測(cè)定等方面所做工作為其作為治療心血管藥物的研究積累了原始數(shù)據(jù)，并為進(jìn)一步的制備純化及藥理模型實(shí)驗(yàn)開(kāi)了頭。由于提取方法的去纖維蛋白核苷酸要求具有生物活性，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程要盡量低溫操作，使制備處于0～5℃。在活性測(cè)定中，由于白瓷板法測(cè)定凝血時(shí)間每次實(shí)驗(yàn)條件不可能完全相同（如溫度、血液流出情況等），所以其完全凝固時(shí)間、空白值不相同，但考慮相對(duì)延長(zhǎng)時(shí)間，仍能看出效應(yīng)。

[1] 周泉生.去纖維蛋白多核苷酸[J].生命的化學(xué),1988(05).

[2] 張龍翔.高級(jí)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)選編[M].北京：高等教育出版社, 1989：1.

[3] 蔡武城,袁厚積.生物物質(zhì)常用化學(xué)分析方法[M].北京：科學(xué)出版社,1982.

[4] 中國(guó)人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中國(guó)藥典二部標(biāo)準(zhǔn)附錄?肝素生物檢定法[S].1995.

[5] 徐濤,王榮廷.臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1986：150.

[6] 徐淑云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2002：886-887.

R927.2

A

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