活血膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

郝玉英 菅艷艷 石妍 邱愛梅 楊永利 楊常敏

活血膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

郝玉英 菅艷艷 石妍 邱愛梅 楊永利 楊常敏

目的建立包頭市中心醫(yī)院臨床驗(yàn)方中藥制劑活血膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜法，對活血膠囊中紅花、黃芪、川芎進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定羥基紅花黃色素A含量。色譜柱采用Agilent TC-C18柱（150mm ×4.6mm，5μm）；以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26：2：72）為流動相；檢測波長為403.0nm。結(jié)果檢測的結(jié)果是羥基紅花黃色素A呈良好的線性關(guān)系，條件是在0.1372～0.9601μg范圍內(nèi)，r=1，平均回收率99.0%，RSD=0.8%（n=6）。結(jié)論該方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可作為活血膠囊的質(zhì)量控制方法。

活血膠囊；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；TLC；HPLC；羥基紅花黃色素A

活血膠囊是我院多年使用的臨床驗(yàn)方，由川芎、紅花、黃芪等8位藥物組成；具有破血逐瘀，通竅止痛的功效。臨床上主要用于治療腦梗塞后循環(huán)缺血、腦供血不足、周圍神經(jīng)病變、神經(jīng)損傷等疾病引起的半身不遂、言語不利、口眼歪斜、肢體麻木等癥。為控制活血膠囊的質(zhì)量，采用了薄層色譜法對該制劑中的川芎、紅花、黃芪進(jìn)行了定性鑒別；對制劑中的羥基紅花黃色素A進(jìn)行含量測定時(shí)采用的是高效液相色譜法從而有效的控制了活血膠囊的質(zhì)量。

1 定性鑒別

本品為藥材粉末和提取物制成的膠囊，方中紅花和黃芪的顯微特征都比較明顯，故建立顯微鑒別，并對處方中的川芎、紅花、黃芪建立了薄層鑒別。

1.1 儀器與試藥由本院提供（批號：20111227、20120128、20120324），模擬樣品為自制。川芎對照藥材（批號：120918-201110）：中國藥品生物制品檢定研究院購買。紅花對照藥材（批號：120907-200609）：中國藥品生物制品檢定研究院購買。黃芪對照藥材（批號：120974-200609）：中國藥品生物制品檢定研究院購買。硅膠G（薄層色譜用）：青島海洋化工廠生產(chǎn)。鋪板器（939型薄層鋪板器）：重慶貝可得公司生產(chǎn)。薄層板：為包頭市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心自制。試劑：薄層色譜鑒別所用試劑均為分析純。

1.2 顯微鑒別正文中各鑒別特征所代表的藥材分別為：纖維成束或散離，直徑8～30μm，壁厚，表面有縱裂紋，初生壁常與次生壁分離，兩端常斷裂成須狀，或較平截（黃芪）?；ǚ哿ｎ悎A形、橢圓形或橄欖形，直徑約至60μm，具3個萌發(fā)孔，外壁有齒狀突起（紅花）。

1.3 薄層鑒別

1.3.1 川芎的鑒別取本品粉末10g，加乙醚50ml，通過1h的加熱回流，進(jìn)行過濾，將濾液揮發(fā)掉，剩余的殘?jiān)屑尤?ml乙醚使其溶解，所得液體作為試品溶液。另外取出1g川芎對照藥材，通過同樣的方法得到溶液。在試驗(yàn)時(shí)使用薄層色譜法，取10μl上述兩種溶液，分別將這兩種液體點(diǎn)在同一硅膠GF254薄層板上，展開劑使用己烷-乙酸乙酯(3：1)，后取出并晾干，放在外光燈(254nm)下檢視，最后放在供試品色譜中，能夠在色譜上相應(yīng)的位置上出現(xiàn)熒光斑點(diǎn)（圖1）。

1.3.2 紅花的鑒別取本品粉末10g，加80%丙酮溶液20ml，密塞，超聲處理20min，濾過，作為供試品溶液。同時(shí)取出0.5g紅花對照藥材，用同樣的方法制成對照藥材溶液。通過薄層色譜法進(jìn)行試驗(yàn)，將上述兩種液體分別取出10μl，同時(shí)將兩種液體分別在同一硅膠G薄層板上進(jìn)行點(diǎn)滴，展開劑使用乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7：2：3：0.4)，后取出并晾干。在供試品色譜中能夠顯出相同顏色的斑點(diǎn)（圖2）。

圖1 活血膠囊中川芎的薄層色譜鑒別方法學(xué)研究圖

圖2 活血膠囊中紅花的薄層色譜鑒別方法學(xué)研究圖

1.3.3 黃芪的鑒別取出5g黃芪粉末，加入30ml乙醚，通過20min的加熱回流，進(jìn)行濾過之后得到殘?jiān)?，殘?jiān)?.3%氫氧化鈉溶液15ml使溶解，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5～6，用乙酸乙酯15ml振搖提取，分取乙酸乙酯液，用濾紙將溶液濾過，濾紙上要鋪上適量的無水硫酸鈉，將濾液蒸干。所得殘?jiān)屑尤?ml乙酯讓殘?jiān)芙猓靡后w作為供試品溶液。取出1g黃芪作為對照藥材，同樣的方法制成對照藥材溶液。通過薄層色譜法進(jìn)行試驗(yàn)，取出10μl上述兩種液體，將它們點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，展開劑使用三氯甲烷-甲醇(10：1)，將液體展開之后取出晾干，放在氨蒸氣中熏后，再放在紫外光燈下進(jìn)行檢視。這時(shí)，在供應(yīng)品色譜中，對照的位置上能夠顯出同樣顏色的熒光性斑點(diǎn)（圖3）。

圖3 活血膠囊中黃芪的薄層色譜鑒別方法學(xué)研究圖

2 羥基紅花黃色素A的含量測定

本品為川芎、紅花、黃芪等8味藥組成的復(fù)方制劑。文獻(xiàn)報(bào)道紅花主要含黃酮類化合物、脂肪酸、色素、揮發(fā)油及多炔等化合物。通過《中國藥典》中對紅花含量的測定方法，對羥基紅花黃色素A含量測定時(shí)采用HPLC法。經(jīng)過特定的分析方法進(jìn)行驗(yàn)證，能夠看出此法具有較好的重現(xiàn)性，同時(shí)有著較強(qiáng)的專屬性，不會干擾其它組分對羥基紅花黃色素A的測定，所以可以納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之中。

2.1 儀器與試藥

2.1.1 儀器島津LC-10ATvp泵，SPD-10Avp型檢測器，島津CLASS-VP工作站，Sartorious BP211D型電子天平。UV-1100型紫外分光光度儀（北京瑞利分析儀器公司）。

2.1.2 試劑與試藥用羥基紅花黃色素A作為試劑（111637-200905，含量以91.8%計(jì)，供含量測定用）：從中國藥品生物制品檢定研究院購買；活血膠囊（批號：20111227、20120128、20120324）由包頭市中心醫(yī)院提供；模擬樣（20120328）自制；色譜純使用乙腈、甲醇，水為高純水，分析純使用其他試劑。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件

2.2.1.1 色譜拉把十八烷基硅烷鍵合硅膠作為色譜柱填充劑，采用AgilentTC-C18柱（150mm× 4.6mm，5μm）作為本實(shí)驗(yàn)研究。

2.2.1.2 流動相的選擇對羥基紅花黃色素A選擇的測定方法采用流動相的形式，對流動相進(jìn)行流動相條件摸索以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26：2：72），在結(jié)果供試品色譜中的羥基紅花黃色素A具有較好的分離度，同時(shí)有著較高的理論板數(shù)，并且能夠長時(shí)間保存，所以作為檢測的流動相。

2.2.1.3 柱溫室溫。

2.2.1.4 檢測波長的選擇取羥基紅花黃色素A對照品適量，使用25%甲醇，制作成1ml含40μg的溶液，在300～500nm波長范圍掃描。得出羥基紅花黃色素A在403.0nm處有最吸收。在檢測時(shí)參照中國藥典2005年版一部“紅花”含量測定項(xiàng)下羥基紅花黃色素A的測定方法，檢測波長選擇403.0nm進(jìn)行。

2.2.1.5 理論板數(shù)的確定根據(jù)多批檢測數(shù)據(jù)中可以看出，要想羥基紅花黃色素A得到較好的分離效果，理論板數(shù)在4000以上即可。但由于不同的色譜柱具有不同的理論板數(shù)，故確定理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2.2 溶劑提取及提取效率的考察

2.2.2.1 選擇提取溶劑測定方法可以參照《中國藥典》2010年版一部“紅花”項(xiàng)下的羥基紅花黃色素A中含量的測定，提取劑為25%的甲醇。

2.2.2.2 考察提取效率提取劑為25%的甲醇50ml進(jìn)行超聲提取，采用超聲法提取，為確保將被測成分完全提取出來，選取30min、40min和50min不同的提取時(shí)間來考察對提取效率的影響（見表1）。

表1 提取效率試驗(yàn)

從表中數(shù)據(jù)可見，超聲處理30min、40min和50min羥基紅花黃色素A的含量基本一致，故超聲提取時(shí)間定為40min。

2.2.2.3 提取溶劑加入量考察在特定的提取過程中，考察溶劑的加入量，結(jié)果見表2。

表2 提取完全試驗(yàn)的考察表

從表中數(shù)據(jù)可見，用25ml溶劑的樣品羥基紅花黃色素A含量較低，用50ml和75ml溶劑的樣品羥基紅花黃色素A含量基本一致，提取完全，所以確定提取溶劑加入量為50ml。

2.2.3 專屬性陰性對照試驗(yàn)：在制備供試品溶液和對照品溶液的時(shí)候按照《中國藥典》2010年版一部“紅花”項(xiàng)下的羥基紅花黃色素A【含量測定】項(xiàng)下的方法制備。制備的缺紅花的陰性對照供試品按照相應(yīng)的處方比例采用相同的工藝，按供試品溶液制備法制得陰性對照溶液。在上述色譜的條件下，精密吸取對照品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液各20ml，分別注入液相色譜儀，得出陰性對照色譜圖和羥基紅花黃色素A對照品以及供試品色譜圖在相對應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，表明其他組分對羥基紅花黃色素A的測定無干擾（見圖4～6）。

圖4 陰性樣品圖

圖5 羥基紅花黃色素A對照品樣品圖

圖6 活血膠囊樣品圖

2.2.4 線性關(guān)系考察精密稱取出適量的取羥基紅花黃色素A對照品適量，加入甲醇（濃度為25%）制成1ml含0.6mg的溶液作為對照品溶液；精密量取上述對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml，置于10ml容器瓶加入甲醇至刻度，搖均勻。取10μl液體至色譜儀進(jìn)行測定，得出羥基紅花黃色素A在0.1372～0.9601μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=14930+32464X，r=1（見表3）。

表3 羥基紅花黃色素A的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)選取同一份供試品溶液，分別在0h、2h、4h、、8h、12h進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

表4 不同時(shí)間測定樣品中羥基紅花黃色素A的峰面積積分值

從表中的數(shù)據(jù)可以看出，在12h內(nèi)羥基紅花黃色素A的峰面積積分值基本穩(wěn)定不變。

2.2.6 精密度選取樣品（批號：20111227），研細(xì)，取6份，按照《中國藥典》2010年版一部“紅花”項(xiàng)下的羥基紅花黃色素A項(xiàng)下的方法操作，測定每份樣品的含量（見表5）。

表5 羥基紅花黃色素A含量重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 準(zhǔn)確度精密稱定實(shí)驗(yàn)供試品（含量0.07mg/粒)9份，每份約1.5g，分別置9個具塞錐形瓶中，同時(shí)分為三組，每組為三份，加入濃度為0.4284 mg/ml的羥基紅花黃色素A溶液，容量分別為1ml、1.2ml、1.5ml（約相當(dāng)于供試品含有量的80.0%、100%、120%），同時(shí)加入25%的甲醇溶液各50ml，總體積為51.0ml、51.2ml和51.5ml，測定每份含量，計(jì)算回收率，具體結(jié)果見表6。

3 樣品含量測定

采用相應(yīng)的含量測定法方測出樣品含量，三批樣品（批號：20111227、20120128、20120324）和一批模擬樣品（20120328）的測定結(jié)果見表7。

從表7中三批樣品和一批模擬樣品測定的數(shù)據(jù)可見，羥基紅花黃色素A的含量在0.07mg/粒以上，考慮到藥材質(zhì)量差異，下浮10%，暫定本品每1g含紅花以羥基紅花黃色素A。

表6 加樣回收率測定結(jié)果

表7 樣品中羥基紅花黃色素A含量測定結(jié)果

4 小結(jié)

該方法簡便、準(zhǔn)確、可靠、可作為活血膠囊的質(zhì)量控制方法。

[1] 肖培根,李大鵬,楊世林,等.新編中藥志[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2001.

[2] 呂武清,龍新華.中成藥中的藥材薄層色譜鑒別[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1996：232-237.

[3] 劉紅訓(xùn).中藥材薄層色譜鑒別[M].天津：科學(xué)技術(shù)出版社,1989.

[4] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會編.中華本草?蒙藥卷[M].上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2004.

[5] 趙文達(dá).常用中藥材組織粉末圖解[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1991.

[6] 徐國鈞.中藥材粉末顯微鑒定[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1986.

[7] 內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳編.內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)[M].赤峰：內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版社,1987.

[8] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典2005年版一部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

R286.0

A

1673-5846（2013）01-0039-04

包頭市中心醫(yī)院門診藥房，內(nèi)蒙包頭 014040