UPLC同時(shí)測定決明子中橙黃決明素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量

詹 雁，阮 佳，譚 鐳，徐超群

（四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041）

0 引 言

決明子為常用中藥，來源于豆科植物決明（cassia obtusifolia L.）和小決明（cassia tora L.）的干燥成熟種子[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱明目、潤腸通便的功效，用于目赤澀痛、羞明多淚、頭痛眩暈、目暗不明、大便秘結(jié)等癥，其主要有效成分為蒽醌類化合物[2]。目前，決明子中蒽醌類化合物檢測常用方法主要有分光光度法[3-4]、高效液相色譜法[5-9]。與分光光度法相比，高效液相色譜法穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性更好，但是對(duì)于多種成分的同時(shí)測定花費(fèi)時(shí)間過長；為此，本文建立了超高效液相色譜法（UPLC），4min內(nèi)可完成橙黃決明素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的分析檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC（美國Waters公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower2色譜工作站）；BP210S電子天平（德國Sartorius公司）；AB135-S 1/10萬天平（METTLER TOLEDO儀器有限公司）。

乙腈（色譜純，美國Sigma公司）；水（樂百氏純凈水）；磷酸、甲醇、鹽酸、三氯甲烷（分析純，成都市科龍化工試劑廠）。

決明子藥材（四川利民中藥飲片有限公司，四川新荷花中藥飲片股份有限公司，四川省中藥飲片有限責(zé)任公司）；橙黃決明素（批號(hào)：111900-201202）、大黃酚（批號(hào):110796-201118）、大黃素（批號(hào)：110756-200110）、大黃素甲醚（批號(hào)：110758-200610）（中國藥品生物制品檢定所）。

1.2 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1mm×50mm×1.7μm，美國Waters公司）；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為284nm；柱溫為30℃；流速為0.6mL/min；進(jìn)樣量為2μL。

表1 梯度洗脫程序

1.3 樣品制備

精密稱取橙黃決明素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品適量，用甲醇制成含橙黃決明素30.02μg/mL、大黃素25.00μg/mL、大黃酚104.30μg/mL和大黃素甲醚59.16μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。分析測試中所用標(biāo)準(zhǔn)溶液由標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液逐步稀釋得到。

取決明子藥材粉末（過三號(hào)篩）約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25mL，蒸干，加稀鹽酸30mL，置水浴中加熱水解1h，立即冷卻，用三氯甲烷振搖提取4次，每次30mL，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)眉状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用0.2μm有機(jī)過濾膜過濾，取續(xù)濾液作待測樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液1.0，2.0，4.0，7.0，10.0mL置于10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，進(jìn)樣測定，以各成分峰面積為縱坐標(biāo)Y，質(zhì)量體積濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表2。結(jié)果顯示各標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.2 精密度

取含橙黃決明素12.008μg/mL、大黃素10.000 μg/mL、大黃酚41.720μg/mL和大黃素甲醚23.664 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.22%，1.05%，1.53%，1.60%，色譜圖見圖1，說明本UPLC方法下儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性

取同一批號(hào)的決明子藥材6份，按1.3方法制備樣品溶液，測定，計(jì)算橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的RSD分別為1.52%，1.27%，1.61%，1.83%，重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性

取同一樣品溶液，于室溫下 0，2，4，6，8，12，24 h分別進(jìn)行測定，以峰面積為指標(biāo)計(jì)算橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為1.15%，1.34%，1.66%，1.76%，說明樣液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 混標(biāo)圖譜（UPLC）

圖2 樣品圖譜(UPLC)

圖3 樣品圖譜(HPLC)

2.5 加樣回收率

精密稱取0.25 g已知含量的決明子藥材粉末（過三號(hào)篩），共9份，分別精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液8，10，12mL，按1.3方法制備樣品溶液，測定，回收率較好，結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)

2.6 樣品測定

圖2為樣品溶液的色譜圖，在本色譜條件下，4種被測成分與其他化合物色譜峰分離度均良好。對(duì)6批次決明子藥材進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

2.7 與HPLC測定方法的比較

建立以下HPLC色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6mm×250mm×5μm，美國 Agilent公司）；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相 B，分別在 A∶B=4∶6 和 A∶B=9∶1 時(shí)進(jìn)行梯度洗脫15min；檢測波長為284 nm；柱溫為30℃；流速為1.0mL/min；進(jìn)樣量為5μL。在此色譜條件下，對(duì)樣品溶液進(jìn)行測定，結(jié)果顯示4種待測成分的分析時(shí)間至少需要32min，測得含量與UPLC法一致，色譜圖見圖3。

表4 10批藥材含量

3 結(jié)束語

與傳統(tǒng)HPLC相比，UPLC能更加快速地分離分析樣品。目前UPLC多應(yīng)用于代謝組學(xué)分析及其他一些生化領(lǐng)域，在天然產(chǎn)物的分析方面運(yùn)用也逐漸興起。本文所建立的UPLC法能有效地把4種蒽醌類成分的分析時(shí)間縮短至4min以內(nèi)，而普通HPLC耗時(shí)超過30min。

本研究所用UPLC方法簡單快速，分析檢測的精密度、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度均較好，能更好地用于決明子中橙黃決明素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的分析檢測。

[1]中華人民共和國國家藥典委員會(huì).中國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：135-136.

[2]郝延軍，桑育黎，趙余慶.決明子的研究進(jìn)展[J].中草藥，2001，32（9）：858-859.

[3]康建，屈凌波，吳擁軍，等.分光光度法測定決明子中總蒽醌含量[J].中醫(yī)研究，2011，24（5）：35-37.

[4]勵(lì)娜，楊榮平，張小梅，等.決明子不同清炒品中蒽醌類成分的含量測定[J].海峽藥學(xué)，2007，19（8）：42-43.

[5]王京霞，許家鸞.決明子中大黃素和大黃酚含量的測定[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（6）：49-50.

[6]譚和平，鄒燕，葉善蓉，等.茶葉中的多酚類物質(zhì)及其分析方法綜述[J].中國測試技術(shù)，2008，34（4）：4-11.

[7]胡軼娟，萬麗，張加雄，等.高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地決明子中橙黃決明素含量[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17（7）：1138-1139.

[8]衛(wèi)瑩芳，謝達(dá)溫，萬麗，等.HPLC梯度洗脫法同時(shí)測定決明子中橙黃決明素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2009，11（6）：868-871.

[9]廖海，周嘉裕，何成生，等.決明子大黃素和大黃酚的提取與含量測定[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18（6）：1332-1333.