基于超薄等電聚焦電泳技術(shù)的大白菜品種鑒定

摘要：利用超薄等電聚焦電泳技術(shù)對(duì)8個(gè)不同的大白菜品種種子蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，大白菜種子鹽溶蛋白具有較高的多態(tài)性，在所測(cè)試的8個(gè)品種中共發(fā)現(xiàn)9條蛋白質(zhì)多態(tài)性條帶，依這9條蛋白質(zhì)多態(tài)性條帶可將8個(gè)品種區(qū)別開來，與大田種植鑒定結(jié)果一致。因此，種子蛋白質(zhì)超薄等電聚焦電泳技術(shù)可應(yīng)用于大白菜品種鑒定。

關(guān)鍵詞：大白菜；鹽溶蛋白；超薄等電聚焦電泳；品種鑒定

中圖分類號(hào)：S634.103.7；Q503 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2013）08-0039-03

大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis） 適應(yīng)范圍廣，栽培面積大，是我國(guó)第一大蔬菜作物_[1]。品種改良是實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素，隨著生產(chǎn)力的發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，大白菜育種日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。為了在較短時(shí)間內(nèi)培育出高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)品系，部分品種采用了共同的親本或自交系，客觀上縮小了品種間的遺傳差異性。近年來，大白菜品種日漸增多，同時(shí)，在生產(chǎn)上假冒偽劣種子事件時(shí)常發(fā)生。因此，鑒定品種真實(shí)性對(duì)大白菜新品種登記和品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等顯得極為重要。

目前，大白菜品種鑒定以大田種植鑒定為主_[2]。盡管大田種植鑒定的結(jié)果最準(zhǔn)確，但其所需時(shí)間比較長(zhǎng)（通常需要一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)），且要消耗大量的人力和物力，而且很多性狀受栽培措施及環(huán)境因素的影響_[3]。為此，迫切需要一種準(zhǔn)確、快速的大白菜品種鑒定方法。

電泳技術(shù)在種子真實(shí)性檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用，根據(jù)電泳對(duì)象的不同可分為同功酶電泳和蛋白質(zhì)電泳。同功酶電泳技術(shù)曾被應(yīng)用于大白菜品種鑒定_[4～7]。利用同工酶鑒別品種及種子純度存在的問題是： 同工酶存在時(shí)期特異性和器官特異性，多數(shù)作物種子需發(fā)芽，由于種子發(fā)芽速度不同造成個(gè)體間差異，容易引起誤差，并且同工酶的提取、電泳等多數(shù)需要在低溫下進(jìn)行，增加了電泳操作和電泳技術(shù)推廣的難度。由于同工酶分析存在上述不利因素，在應(yīng)用中受到限制_[7]。普通聚丙烯酰胺凝膠電泳也應(yīng)用于品種鑒定，結(jié)果表明蛋白質(zhì)多樣性位點(diǎn)的變化不足以區(qū)分所有的品種_[5，8]。分子標(biāo)記作為一種新的基于DNA水平多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，具有許多優(yōu)勢(shì)。分子標(biāo)記技術(shù)越來越多地應(yīng)用于大白菜的品種鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建_[7～13]。但分子標(biāo)記費(fèi)用高，操作復(fù)雜，使它的應(yīng)用受到了限制。

種子蛋白質(zhì)超薄等電聚焦電泳 （Ultrathin-layer Isoelectric Focusing， 簡(jiǎn)稱為UTLIEF）是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，該法在番茄_[14]、水稻_[15]、玉米_[16]、南瓜_[17]等品種鑒定上取得較好結(jié)果。目前還未見到利用該技術(shù)鑒定大白菜品種的報(bào)道。 本研究首次利用UTLIEF技術(shù)，對(duì)當(dāng)前生產(chǎn)上栽培面積較大的部分大白菜品種進(jìn)行鑒定，辨別真?zhèn)?，為這些品種的管理提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

所用大白菜品種為87-114、神州5號(hào)、強(qiáng)者、強(qiáng)勢(shì)、菊錦、春月黃、冠春、CR黃心秋，均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院程險(xiǎn)峰老師提供。

1.2種子蛋白質(zhì)的提取

取上述不同品種單粒種子放在濾紙上，用研槌逐粒壓碎，去殼，置于離心管中，按30∶1（V/W）比例加入蛋白提取液。常溫下提取1 h后，10 000 r/min離心10 min。上清液20 μl用于電泳點(diǎn)樣。本研究采用3種不同提取液：去離子水、0.01%（W/V）NaCl溶液和30%（V/V）2-氯乙醇。

1.3超薄等電聚焦電泳

按國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程_[18]進(jìn)行。本研究采用4種不同pH范圍的兩性電解質(zhì)（3.0～9.5，4.0～7.0，5.0～8.0，6.0～9.0）。

1.4大田種植鑒定

大田種植鑒定在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽試驗(yàn)站進(jìn)行。在苗期、蓮座期、結(jié)球期，根據(jù)葉片顏色、厚薄、形狀；在收獲前， 根據(jù)葉色、葉球抱合方式、球的形態(tài)等特征特性鑒定不同品種。

2結(jié)果與分析

2.1超薄等電聚焦電泳鑒定

為了找到合適的蛋白質(zhì)提取液和合適的pH范圍，本研究利用3種不同的提取液結(jié)合4種不同pH范圍的兩性電解質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用0.01%（W/V）NaCl溶液和pH范圍為5.0～8.0的兩性電解質(zhì)試驗(yàn)時(shí)，得到的蛋白質(zhì)圖譜更清晰，多態(tài)性條帶更多（圖1）。其中靠近正極的染色較深，多態(tài)性低，而靠近負(fù)極的染色淺，多態(tài)性高，8個(gè)大白菜品種在9個(gè)位點(diǎn)上出現(xiàn)了多態(tài)性。

不同大白菜品種種子所含的多態(tài)性蛋白條帶不同（表1），根據(jù)所含蛋白質(zhì)多態(tài)性條帶差異，很容易將這8個(gè)品種區(qū)分開。

3討論與結(jié)論

大白菜品種類型多樣，為了對(duì)商品種子進(jìn)行品種鑒別、新品種登記測(cè)試以及種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，非常需要一種高效、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)實(shí)用的品種鑒別技術(shù)。

蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，其位點(diǎn)差異代表了植物生物學(xué)特性的多態(tài)性。種子蛋白質(zhì)電泳技術(shù)不需發(fā)芽，省時(shí)、省力，試驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定，不易受外界條件影響，已成為主要農(nóng)作物種子純度檢測(cè)的主要手段。超薄等電聚焦電泳技術(shù)分辨率高_[19]，和普通的聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，能檢測(cè)出更多的總蛋白和多態(tài)性蛋白條帶_[14～17]。

本研究結(jié)果表明，超薄等電聚焦電泳能在不同的大白菜品種種子蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)較多的多態(tài)性條帶，從而將不同的品種區(qū)分開來，與大田種植鑒定結(jié)果一致。因此，種子蛋白質(zhì)超薄等電聚焦電泳是一種可靠、簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)的大白菜品種鑒定技術(shù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]馬京波，姜善濤，崔漢良，等. 早熟大白菜品種金來秋白2號(hào)的選育及栽培技術(shù)[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，44（3）：123-124.

[2]王桂娥. 大白菜雜交種子純度種植鑒定技術(shù)[J]. 種子科技，1996，2：39.

[3]林文超，王德森，劉維信. 不同環(huán)境條件對(duì)紫色大白菜花青素穩(wěn)定性的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，44（1）：51-53.

[4]鄭曉鷹，劉巖. 用過氧化物酶及脂酶同功酶鑒定大白菜雜交種純度[J]. 園藝學(xué)報(bào)，1994，21（1）： 59- 64.

[5]鄭曉鷹，李麗，李秀清. 大白菜品種同功酶及水溶蛋白的遺傳多樣性分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，1997，24（3）： 244- 248.

[6]陳啟林，陳毓荃，陳靜，等. 同工酶PAGE凝膠電泳在大白菜品種鑒定中的應(yīng)用研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1998，7（2）： 94-97.

[7]Arus P C， Shields R， Citon T J. Application of isozyme electrophoresis for purity testing and cultivar identification of F1 hybrids of Brassica oleracea[J]. Euphytica， 1985，34： 651-657.

[8]張承毅， 吳承來， 張春慶. 蛋白質(zhì)電泳法鑒定大白菜種子純度[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，3： 108-110.

[9]宋順華， 鄭曉鷹， 徐家炳， 等.大白菜種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006， 21（3）： 86-90.

[10]周新成，劉立峰，李化銀，等. 大白菜EST-SSR標(biāo)記開發(fā)中非SSR標(biāo)記的鑒別[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，4： 1-3， 7.

[11]張庶，李利斌，王鳳德，等. 利用 cDNA-AFLP 分析大白菜、蘿卜及其雜交種差異表達(dá)基因[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，7：1-4，8.

[12]王燕龍，姜言生，曲志才，等. SSR 分子標(biāo)記在作物種質(zhì)資源鑒定中的應(yīng)用[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，44（10） ： 11-18.

[13]馮英，張秦英，劉莉， 等. 青麻葉大白菜種質(zhì)資源遺傳多樣性的AFLP分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（3）：56-59.

[14]Van den Berg B M. Inbred testing of tomato （Lycopersicon esculentum L.） F1 varieties by ultrathin-layer isoelectric focusing of seed protein [J]. Electrophoresis，1990，11（10）：824-829.

[15]Zhao T， Yan M， Lu Y P， et al. Genetic purity testing of two-line hybrid rice seeds by ultrathin-layer isoelectric focusing of proteins [J]. Seed Science and Technology，2005，33（2）：45-52.

[16]嚴(yán)敏，王曉峰. 雜交玉米、水稻和辣椒種子品種真實(shí)性和純度的室內(nèi)快速鑒定[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003， 2：6-8.

[17]Tu H， Zhang J Q， Wang X F. Variation in seed protein within and among species of Cucurbita by ultrathin-layer isoelectric focusing [J]. Seed Science and Technology，2012，40（3）：113-117.

[18]International Seed Testing Association （ISTA）. International Rules for Seed Testing： Edition 2007 （1st ed.） [M]. Bassersdorf， 2007.

[19]Radola B J. Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanized glass plates or polyester films [J]. Electrophoresis，1980，1（1）：43-56.