山東常用墊料發(fā)酵菌制劑中有效菌的分析鑒定

王春蕾　曹頂國　李福偉等

摘 要：

選擇山東省內(nèi)應(yīng)用范圍廣、宣傳力度大的不同劑型墊料發(fā)酵菌劑，采用微生物培養(yǎng)結(jié)合分子生物學(xué)的方法分離和鑒定其中的好氧發(fā)酵菌，并對其進(jìn)化關(guān)系做了初步分析。結(jié)果顯示：不同來源的發(fā)酵菌劑中主要有效菌均為芽孢桿菌屬，菌種數(shù)量在108個(gè)/g以上，其有效菌間遺傳進(jìn)化關(guān)系很近，同源性都在99%以上；紅糖水培養(yǎng)對發(fā)酵菌劑E、F的增殖效果不穩(wěn)定，培養(yǎng)液中含菌量都不到108個(gè)/g，粉劑型含菌量高且穩(wěn)定、更經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

關(guān)鍵詞：山東省；墊料；發(fā)酵菌劑；有效菌；分析鑒定

中圖分類號：TQ920.1文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）09-0075-04

菌種是制作發(fā)酵床成功的關(guān)鍵因素。目前，山東省內(nèi)用于墊料發(fā)酵的菌制劑來源復(fù)雜，劑型多樣。從劑型看，有袋裝粉劑、瓶裝水劑、瓶裝凍干粉等。其中，袋裝粉劑和水劑可直接拌入墊料中使用，而瓶裝凍干粉劑則需要用紅糖水增殖后使用。從發(fā)酵菌劑來源看，山東省應(yīng)用較多的商品菌劑包括源自日本的洛東酵素、山東省本地企業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵床專用菌以及廣西、河南等地的一些發(fā)酵床專用菌。有的發(fā)酵菌劑為單一的芽孢桿菌，直接作為墊料接種菌，而大部分菌劑為復(fù)合型菌種，標(biāo)稱的主要成分包括乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌、光合菌、絲狀真菌、放線菌等有益微生物菌群及其代謝產(chǎn)物（消化酶、蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、氨基酸、維生素等）。不同研究都報(bào)道了某一菌種發(fā)酵速度快、效果好[1～3]，還有研究顯示了復(fù)合菌種的效果要優(yōu)于單一菌種[4]。然而，墊料的成分和高溫發(fā)酵過程并不適合復(fù)合菌劑中部分菌種的代謝繁殖。

為研究墊料發(fā)酵菌劑中的菌種種類、數(shù)量和在墊料發(fā)酵過程中的作用，筆者分別選擇山東省內(nèi)應(yīng)用范圍廣、宣傳力度大的不同劑型的墊料發(fā)酵菌制劑，采用微生物培養(yǎng)結(jié)合分子生物學(xué)的方法，分離和鑒定其中的好氧發(fā)酵菌，并對其進(jìn)化關(guān)系做了初步分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山東不同公司的發(fā)酵菌劑A、發(fā)酵菌劑B、發(fā)酵菌劑C，國外進(jìn)口的發(fā)酵菌劑D，河南不同公司的發(fā)酵菌劑E及其紅糖水稀釋液E0、發(fā)酵菌劑F及其紅糖水稀釋液F0。

1.2 試驗(yàn)儀器

試管，培養(yǎng)皿，1 000、200 μl移液槍及槍頭，立式高壓滅菌鍋LS-B50L，恒溫培養(yǎng)箱SLI-700，超凈工作臺SW-CJ-1F，酒精燈，試管架，電子天平，1 L三角瓶，藥匙。

1.3 試驗(yàn)方法

制備酵母膏蛋白胨（LB）培養(yǎng)基[5]、PDA培養(yǎng)基[6]、高氏1號培養(yǎng)基[5]、亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基[7]、光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基[8]和溴甲酚綠指示劑培養(yǎng)基[9]，趁熱注入培養(yǎng)皿中，凝成平板，待用。 每種發(fā)酵菌劑稱取0.5 g樣品于100 ml生理鹽水中，搖動(dòng)10 min后，進(jìn)行梯度稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8各200 μl分別涂布于待用的培養(yǎng)皿中，每個(gè)梯度重復(fù)3次，30℃恒溫箱培養(yǎng)，每24 h觀察1次菌落生長狀況并采用科學(xué)計(jì)數(shù)法作記錄。

待培養(yǎng)基上出現(xiàn)微生物菌落并統(tǒng)計(jì)完數(shù)據(jù)后，挑取不同形態(tài)的數(shù)個(gè)菌落分別在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)，待培養(yǎng)1天后，菌液渾濁，單菌長成。此時(shí)，用細(xì)菌抽提DNA試劑盒對單菌菌液提取純菌DNA，隨后以其DNA為模板、F24和R1492為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物片段長度在1 500 bp，送濟(jì)南力戈有限公司測序，最后將測序結(jié)果提交到NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/）上的GenBank數(shù)據(jù)庫登記，用Blast軟件檢索數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行相似性比較，獲得同源性較高的相關(guān)菌株的16S rDNA基因序列，明確具體菌種情況并做DNAstar相似性比較和遺傳進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌劑在培養(yǎng)基上的菌落生長狀況

試驗(yàn)結(jié)果表明，所有試驗(yàn)發(fā)酵菌劑在LB培養(yǎng)基上生長最為旺盛，在亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基和光合細(xì)菌培養(yǎng)基上不生長；發(fā)酵菌劑C在6種培養(yǎng)基上均無菌落生長；發(fā)酵菌劑D除在LB培養(yǎng)基上生長較好外，在其它培養(yǎng)基上均未見菌落生長；在高氏1號培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后發(fā)酵菌劑A、B、E、F出現(xiàn)較多菌落。從劑型上分析，粉劑型培養(yǎng)得到活菌數(shù)量較水劑型更大些，在108個(gè)/g以上，發(fā)酵菌劑E0培養(yǎng)菌的數(shù)量明顯低于其他菌劑。從活菌數(shù)量上，在考慮到試驗(yàn)操作過程中因缺氧死亡的數(shù)量，發(fā)酵菌劑A、B、D、E、F培養(yǎng)的活菌量基本能達(dá)到標(biāo)定的數(shù)量（>109個(gè)/g），可以在發(fā)酵墊料使用中達(dá)到較好的效果（表1）。

2.2 不同發(fā)酵菌劑間優(yōu)勢菌分析鑒定

選取從土壤樣品中提取的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌為標(biāo)準(zhǔn)菌，對發(fā)酵菌劑間優(yōu)勢菌序列相似性比較及遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1、圖2）顯示：發(fā)酵菌劑D在遺傳進(jìn)化上與枯草芽孢桿菌最近；發(fā)酵菌劑E、發(fā)酵菌劑E0、發(fā)酵菌劑A序列與地衣芽孢桿菌序列相似性較近；發(fā)酵菌劑F、發(fā)酵菌劑F0、發(fā)酵菌劑B的序列與解淀粉芽孢桿菌序列相似性也較高。經(jīng)分析鑒定，各發(fā)酵菌劑分離得到的優(yōu)勢菌都屬于芽孢桿菌屬，且同源性都在99%以上，遺傳進(jìn)化關(guān)系很近。因此，各發(fā)酵菌劑間的優(yōu)勢菌基本無差別，是所需要的芽孢桿菌屬菌種，適合添加到山東地區(qū)常用墊料中，可放心使用。

2.3 紅糖水培養(yǎng)前的發(fā)酵菌劑與培養(yǎng)后的比較分析

圖3、圖4和表1顯示，同一培養(yǎng)基上，經(jīng)紅糖水培養(yǎng)后的發(fā)酵菌E0在濃度梯度為10-5上的菌落生長狀態(tài)比發(fā)酵菌E的10-8濃度梯度的狀態(tài)要旺盛些，但相對同一濃度梯度上生長的菌落要低3個(gè)數(shù)量級；發(fā)酵菌F和F0在同一濃度梯度上的菌落生長狀態(tài)和數(shù)量都基本一致。因此，從菌落生長數(shù)量上得知，發(fā)酵菌劑E凍干粉直接稀釋培養(yǎng)的菌種生長狀態(tài)比添加紅糖水培養(yǎng)后的效果好些，而發(fā)酵菌劑F凍干粉培養(yǎng)效果與紅糖水增殖后培養(yǎng)效果幾乎無差別。結(jié)果表明，紅糖水培養(yǎng)對菌的增殖效果不穩(wěn)定，凍干粉菌劑可直接與墊料混合使用，且活菌含量高、穩(wěn)定、更方便實(shí)用。

3 結(jié)論與討論

從鑒定的這幾種不同來源的發(fā)酵菌劑分析，發(fā)酵菌劑中主要成分是芽孢桿菌屬，這與王曉霞等（2006）[10]研究發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌具有很強(qiáng)的生物同化作用，能有效改善畜禽養(yǎng)殖環(huán)境的結(jié)果是一致的?？梢姡挎邨U菌屬是發(fā)酵菌制劑中的優(yōu)勢菌。

對于試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)量，作為驗(yàn)證菌活力的指標(biāo)也有一定價(jià)值，只是本試驗(yàn)獲取的數(shù)據(jù)可能會受各種外界條件的影響而略有偏低，比如，發(fā)酵菌種中的菌多是需氧菌，而在用生理鹽水梯度稀釋中會造成部分菌的死亡，從而影響活菌數(shù)量，但每一種發(fā)酵菌劑在LB、PDA、溴甲酚綠指示劑、高氏1號培養(yǎng)基上生長都會受到同樣的影響，活菌數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果也存在相似的差值，所以，所得活菌數(shù)的結(jié)果仍可作為各發(fā)酵菌相互比較的依據(jù)。

對于發(fā)酵菌劑D而言，它是比較單一的純菌劑，主要含有固定的一種菌，培養(yǎng)鑒定結(jié)果也證實(shí)了這一菌劑標(biāo)稱的主要成分[11]，因此，只在LB培養(yǎng)基上能夠良好的生長。發(fā)酵菌劑F可能因不含有真菌類菌種而不能在PDA培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵菌劑E0、F0分別在高氏1號培養(yǎng)基上未見菌落，可能是由于液體培養(yǎng)使放線菌產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物抑制了放線菌的生長而引起的[12]。

另外，分析滅菌紅糖水對凍干粉菌劑中菌的增殖試驗(yàn)得知，紅糖水培養(yǎng)對發(fā)酵菌劑E、F的增殖效果不穩(wěn)定，培養(yǎng)液中含菌量都不到108個(gè)/g，還增加了紅糖水培養(yǎng)的成本，且這種培養(yǎng)液需要及時(shí)使用，才能保證有效活菌數(shù)量，否則培養(yǎng)液會因長時(shí)間放置導(dǎo)致無活菌存活。

根據(jù)菌落的生長狀況分析，袋裝粉劑含菌量要高些，凍干粉次之，加以考慮到培養(yǎng)液的時(shí)效，因此，袋裝粉劑和瓶裝凍干粉菌劑可以直接與墊料混合使用，更方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]

劉 濤，黃保華，石天虹，等. 一株發(fā)酵床接種用枯草芽孢桿菌的分離鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，11：71-73，76.

[2] 劉 娟，王新海，李永春，等.發(fā)酵床生態(tài)養(yǎng)豬技術(shù)在江蘇省邳州市的應(yīng)用與推廣[J].畜牧與飼料科學(xué)，2011，32（8）：74-76.

[3] 葉耀輝.發(fā)酵床零排放養(yǎng)豬模式的探索與應(yīng)用[J].福建畜牧獸醫(yī)，2011，33（1）：61-65.

[4] 張 超，單安山.枯草芽孢桿菌在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].飼料研究，2011，9：19-20.

[5] 莎姆布魯克 J，拉塞爾 D W著. 黃培堂譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].北京：科學(xué)出版社，2005.

[6] 劉尹強(qiáng)，王雅平，潘乃穟.馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：北京大學(xué)，93104723 [P].2000-03-01.

[7] 廖雪義，馬廣庭，藍(lán) 榮，等.亞硝化作用菌種的分離篩選及條件選擇[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（5）：1259-1261.

[8] 鐘為章，羅一箐，張忠智，等.紅螺菌科光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].化工與生物工程，2009，7：67-69.

[9] 王友湘，陳慶森，閻亞麗，等.用于乳酸菌分離鑒定的幾種培養(yǎng)基的篩選及應(yīng)用[J].食品科學(xué)，2007，9：374-378.

[10]王曉霞，易中華，計(jì) 成，等.果寡糖和枯草芽孢桿菌對肉雞腸道菌群數(shù)量、發(fā)酵糞中氨氣和硫化氫散發(fā)量及營養(yǎng)素利用率的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37（4）：337-341.

[11]洛東酵素NK600[J].農(nóng)業(yè)知識（科學(xué)養(yǎng)殖），2010，6：18.

[12]周長林.微生物學(xué)[M].北京：中國醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)出版社，2004.