Q—開關激光對黃褐斑動物模型黑素細胞病理形態(tài)的影響

楊鵬　楊慧蘭　麥躍　戴勇　孫林潮　魯東平

[摘要]目的：探討Q-開光1064nm Nd：YAG激光不同能量照射對黃褐斑動物模型表皮黑素細胞病理形態(tài)的影響。方法：用Q-開關1064nm Nd：YAG激光不同能量和頻率照射黃褐斑動物模型背部皮膚，分別于激光照射前和照射后不同階段取材，通過HMB45免疫組化染色法，光鏡觀察豚鼠表皮黑素細胞的變化。結果：第一次激光照射后即刻可見高能量兩組黑素陽性細胞減少，第5次激光照射后即刻可見低能高頻組黑素陽性細胞減少。與術前比較，低能量密度低頻率照射組黑素細胞陽性細胞數(shù)無顯著差異。5次治療后軟件分析結果顯示，高能高頻、高能低頻和低能高頻組與照射前比較黑素細胞陽性目標個數(shù)、平均數(shù)密度、平均光密度下降，但平均灰度值上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結論：高能量密度Q-開光 Nd： YAG激光照射對表皮黑素細胞的影響大于低能量密度，當其超過一定閾值時能高能量高頻率可導致黑素細胞的損傷和減少。從而為臨床應用Q-開關1064nm Nd：YAG激光治療色素性疾病提供了實驗依據(jù)。

[關鍵詞]激光；黑素細胞；黑素；光鏡；動物模型

[中圖分類號]R758.4+2 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）09-0941-06

Q-開關激光技術的應用和選擇性光熱作用原理的提出[1-2]，色素增加性疾病的治療取得豐碩的成果，對于黃褐斑的治療雖然療效也令人比較滿意[3-4]，但褒貶不一樣，同時還是存在一定的副作用和治療風險[5]。目前對Q-開關Nd：YAG 激光治療色素增加性皮膚病機理的認識主要還是選擇性光熱作用理論的光致破裂作用，而對Q-開關Nd：YAG激光照射可能存在的對表皮黑素細胞生物學和病理形態(tài)的影響卻并不清楚。黑素細胞是皮膚唯一能合成黑素的細胞， 是多種皮膚色素沉著性疾病的靶細胞，并參與皮膚的免疫反應和光老化的過程。對激光照射黑素細胞的病理形態(tài)研究為Q-開關Nd：YAG激光有效用于臨床黃褐斑的治療提供基礎實驗和理論依據(jù)?，F(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：根據(jù)文獻[6]制作慢性應激抑郁型豚鼠黃褐斑實驗動物模型12只。

1.1.2主要試劑和儀器：HMB45 （melanoma 黑素瘤） 鼠抗人單克隆抗體即用型試劑盒（福建邁新公司）；Q-switched Nd：YAG激光儀（Medlite C6，美國HoYa-ConBio公司）；光學顯微鏡（Olympus公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1照射方法：取慢性應激抑郁型小鼠黃褐斑實驗動物模型造模12只，將每只小鼠裸露皮膚劃分成A（左上區(qū)域）、B（右上區(qū)域）、C（左下區(qū)域）、D（右下區(qū)域）四個區(qū)域。分別代表不同參數(shù)治療區(qū)。A區(qū)代表高能量低頻率區(qū)：3mm光斑 2.5J/cm2，頻率1Hz；B區(qū)代表高能量高頻率區(qū)：3mm光斑，2.5J/cm2，頻率10Hz；C區(qū)代表低能量高頻率區(qū)：3mm光斑，1.5J/cm2，頻率10Hz；D 區(qū)代表低能量低頻率區(qū)：3mm光斑，1.5J/cm2，頻率1Hz。每組照射1分鐘，每周照射一次，共照射5次。實驗設每只小鼠自身激光術前為對照。

1.2.2取材方法：分別于激光治療術前，第1次術后即刻、第5次術后即刻、術后1周、術后3周五次分別切取不同治療區(qū)約1.0cm×0.2cm全層去毛皮膚一條，術后絲線縫合。根據(jù)組織病理和細胞培養(yǎng)觀察需要進行處理保存。其中第一次照射前的取材為正常對照。

1.2.3 HMB45免疫組化方法[7]：10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片。黑色素標記采用免疫組織化學技術-鏈霉菌素·生物素法，再經(jīng)脫蠟至水化、抗原修復后，用HMB45（melanoma黑素瘤）為第一抗體，免疫組化二步法，DAB顯色，蘇木素復染。用PBS代替一抗做陰性對照。

1.2.4 顯微鏡圖像分析[8]：采用病理圖像分析系統(tǒng)對目標圖像進行定量分析，每張切片隨機在顯微鏡物鏡400×下選擇5個不重疊視野進行彩色圖像采集與存儲，計算出每個視野中的陽性目標面積、目標個數(shù)、平均灰度值等。

1.3統(tǒng)計學處理：SPSS17.0統(tǒng)計學軟件，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，計量數(shù)據(jù)采用t檢驗。組間差異運用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1肉眼觀察：治療后創(chuàng)面均出現(xiàn)輕微紅腫，高能量區(qū)針尖樣出血，2～3日后逐漸結癡，5～6日后開始脫落。低能量區(qū)皮膚微紅，高能高頻區(qū)第三次照射后開始出現(xiàn)點狀白斑，其他兩組與低能低頻區(qū)激光治療區(qū)照射后1周豚鼠皮膚顏色相比減淡明顯。

2.2皮膚黑素細胞的病理形態(tài)學觀察 激光術前可見豚鼠表皮基底細胞和棘細胞層中可見成簇分布的黑素細胞，呈強陽性反應。第5次照射后即刻可見高能量高頻率和高能量低頻率照射組黑素陽性細胞數(shù)量明顯減少。低能高頻組照射后一周可見黑素陽性細胞數(shù)量少量減少（圖1）。

2.3激光照射后對各區(qū)豚鼠皮膚黑素細胞陽性目標數(shù)量、數(shù)密度影響：數(shù)密度是指細胞個數(shù)與靶目標面積的比值，是形態(tài)計量學中衡量空間中某種粒子數(shù)目多少的結構參數(shù)。

2.3.1豚鼠皮膚黑素細胞數(shù)密度比較： 采用單因素方差分析各時間點比較，經(jīng)5次照射后，高能高頻、高能低頻、低能高頻組術后1 周豚鼠皮膚黑素細胞數(shù)密度呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（F=311.922，P<0.01；F=14.106，P<0.01；F=4.556，P<0.01）。高能高頻組和高能低頻組與術前比較在第1次激光照射后即刻明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。低能高頻組與術前比較在第5次照射后即刻黑素細胞數(shù)密度下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。低能低頻經(jīng)5次照射后與術前對照比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組間比較：第1次激光照射后即刻高能量兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；低能量兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；而高能高頻與低能量兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；第5次照射后即刻、照射后一周、照射后三周各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；低能低頻組在每個時間上與其他各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表1與圖1。

2.3.2豚鼠皮膚黑素細胞陽性目標數(shù)量比較： 采用單因素方差分析各時間點比較，經(jīng)5次照射后，高能高頻、高能低頻、低能高頻組術后1 周豚鼠皮膚黑素細胞陽性目標數(shù)量呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（F=394.170，P<0.01；F=277.206，P<0.01；F=20.087，P<0.01）。采用最小顯著差法比較高能高頻組和高能低頻組每次照射時間點與術前比較在第1次激光術后即刻明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。低能高頻區(qū)在第5次術后即刻與與術前對照比較黑素細胞陽性目標數(shù)量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。低能低頻經(jīng)5次照射后與術前對照比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組間比較：第1次激光照射后即刻高能低頻與低能量兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；低能量兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；而高能高頻與低能量兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；第5次照射后即刻、術后一周、術后三周各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；低能低頻組在每個時間上與其他各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表2與圖2。

2.4小鼠表皮黑色素沉著深淺度： 豚鼠黑色素細胞染色深淺度用灰度值或光密度值表示，顏色越深，灰度值越小，光密度越大。

2.4.1平均灰度值比較： 采用單因素方差分析，隨著5次照射后，高能高頻組、高能低頻組、低能高頻組激光治療術后1 周平均灰度值呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（F=301.183，P<0.01；F=341.980，P<0.01；F=132.389，P<0.01）。采用最小顯著差法比較高能高頻組和高能低頻組每次照射時間點與照射前比較在第1次激光照射后即刻平均灰度值明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。低能高頻組在第5次照射后即刻平均灰度值明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。低能低頻組經(jīng)5次照射后與術前對照比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組間比較：第1次激光照射后即刻高能量兩組與低能量兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P>0.05）；低能量兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；高能高頻與低頻兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；第5次照射后即刻、照射后一周、照射后三周各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；低能低頻組在每個時間上與其他各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表3和圖3。

2.4.2平均光密度值比較： 采用單因素方差分析，隨著5次照射后，高能高頻組、高能低頻組、低能高頻組激光治療照射后1 周平均光密度值呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（F=95.903，P<0.01；F=29.697，P<0.01；F=28.205，P<0.01）。采用最小顯著差法比較高能高頻組和高能低頻組每次照射時間點與照射前比較在第1次激光照射后即刻平均光密度值明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。低能高頻組在第5次照射后即刻平均光密度值明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各組間比較：第1次激光照射后即刻高能兩組與低能低頻組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P>0.05）；低能高頻組與其他三組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；高能高頻與高能低頻兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；第5次照射后即刻、照射后一周、照射后三周各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；低能低頻組在每個時間點上與其他各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見表4與圖4。

3 討論

隨著激光的誕生，成為黃褐斑一種新的治療手段，早期根據(jù)選擇性光熱作用理論普遍使用Q-開關紅寶石與翠綠寶石激光[10]及CO2激光[11]高能量治療黃褐斑，但均不理想，結果顯示：色素無明顯改善的情況下大部分病例均出現(xiàn)色素加深，活檢顯示治療后表皮和真皮受到損傷，數(shù)月后表皮色素才恢復到治療前。從臨床Q開關Nd：YAG激光治療黃褐斑經(jīng)驗來看，當激光能量較以往治療能量稍微偏高時，很容易出現(xiàn)黃褐斑病變區(qū)色素加深的現(xiàn)象[12]。隨著激光多年的發(fā)展，Polnikorn[13]嘗試以大光斑，小能量，高頻率，多次治療的方式治療，報道取得良好效果，無色素沉著的副作用。漸漸此方法被廣泛應用。Watanabe[14]認為激光在高能量下可能誘發(fā)了更嚴重的損傷，表皮炎癥反應刺激表皮層的黑素細胞改變了黑素細胞和一些免疫細胞的活性[3]，甚至可以導致黑素合成增加，形成炎癥后色素沉著。而大光斑、低能量、多次反復的方法可只針對黑素顆粒進行多次光爆破，可以使黑素顆粒更微小化，從而盡量避免或減少對黑素細胞的激活，使黑素細胞功能失活或抑制，這種理論即稱為“亞細胞選擇性光熱解作用”[15]。Mun等[16]通過一種立體表面成像新技術觀察MC的三維結構也證實了這一點，也可以最大程度減少激光對正常皮膚組織和基底膜的損害，避免PIH的發(fā)生。2010年，Wattanakrai等[17]提出雖然單次照射的能量密度較小，但是多次照射能量的累積可能超過了激光標準的安全能量，長期的安全性尚不清楚。臨床中治療樣本的逐漸擴大，發(fā)現(xiàn)而低能量長時間治療后又出現(xiàn)點狀白斑[5]。提示低能量持續(xù)累加能量可能導致對黑素細胞的損傷。

該實驗結果顯示，高能高頻、高能低頻和低能高頻組經(jīng)5次照射后豚鼠皮膚黑素細胞陽性個數(shù)、數(shù)密度、光密度值不同程度降低，平均灰度值上升。并且高能量不同頻率組在第一次照射后即刻就對色素細胞產(chǎn)生影響，高能和低能兩組的比較提示與Polla等[18]實驗結果一致，激光對黑素細胞的作用與激光流量相關，高能量可能直接導致黑素細胞和周圍組織的損傷，通過表皮炎癥反應激活了黑素細胞，導致黑素合成增加，形成炎癥后色素沉著。高能高頻區(qū)第二次照射后出現(xiàn)點狀白斑，可能激光在高頻能量照射下超過黑素細胞自身存活耐受能量，或?qū)χ車M織損傷過大，導致局部色素減退。低能量低頻率組5次照射后未見明顯變化，而低能量組通過高頻多次照射后同樣顯示出豚鼠皮膚黑素細胞陽性個數(shù)、數(shù)密度、光密度值不同程度降低，平均灰度值上升。說明低能量連續(xù)多次的能量累加可以造成對黑素細胞的影響。也就是說當激光照射的能量密度累積達到一定閾值時，會對黑素細胞造成一定的影響。近來國內(nèi)外有大量研究表明[16]，大光斑、低能量密度多次治療與高能量、小光斑少次治療療效一致，但減少了不良反應的發(fā)生，本研究結果與之相符。從而指導我們臨床激光治療中能量和頻率的選擇，當我們需要選擇大能量進行爆破些，盡量選擇低頻率以減少對黑素細胞和周圍組織的損傷。對于色素細胞活性增強皮膚病治療，為減少過高的能量參數(shù)會出現(xiàn)長時間的炎癥后紅斑，可能引發(fā)PIH或者色素脫失斑，甚至引起瘢痕形成，可使用低能量高頻率多次治療。同時，黑素細胞對累積激光照射能量密度耐受閾值，有待進一步研究。為利于將來黃褐斑的激光治療制定個性化治療方案。

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[收稿日期]2013-04-06 [修回日期]2013-05-03

編輯/張惠娟