LC-MS/MS法分析西藏不同產(chǎn)地大花紅景天中主要化學(xué)組成*

唐誠(chéng)芳，蔣思萍，陳 彬，徐愛國(guó)，周海云， 劉 嵐

(1．中山大學(xué)測(cè)試中心，廣東 廣州 510275；2.西藏自治區(qū)高原生物研究所，西藏 拉薩 850001；3.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510275)

紅景天屬植物為景天科(Crassulaceae)紅景天屬(Rhodiola)植物。我國(guó)紅景天植物有 70 余種，主要分布在西南、西北、華北、華中及東北地區(qū)，西南及西北地區(qū)種類多，蘊(yùn)藏量較大。西藏產(chǎn)30余種，資源分布較豐富，種類及蘊(yùn)藏量均占世界首位[1]。紅景天植物中的大花紅景天別名寬瓣紅景天、寬葉景天,是紅景天的優(yōu)良品種之一，已先后收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藏藥標(biāo)準(zhǔn)》和《中國(guó)藥典》2005年、2010年版[2]。

據(jù)報(bào)道，紅景天富含苯乙醇類、黃酮類、萜類、有機(jī)酸類等成分[3]，具有刺激神經(jīng)系統(tǒng)，改善睡眠、保護(hù)心血管特性、抗腫瘤、抗輻射、抗抑郁、抗炎等藥理作用[4-5]?，F(xiàn)有研究表明，不同產(chǎn)地之間紅景天藥材其化學(xué)成分存在一定的差異[6-7]，本文采用UPLC-ESI- MS/MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定了6個(gè)采自西藏不同地區(qū)的大花紅景天植物藥材的甲醇提取液，利用ESI-MS得到的信息結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)主要譜峰進(jìn)行歸屬，并比較相關(guān)化合物相對(duì)含量的差異，為合理開發(fā)西藏大花紅景天藥用植物資源提供參考。

1 儀器與試藥

TSQ Quantum Ultra三重四極桿串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀(Thermofisher)，配ESI離子源，自動(dòng)進(jìn)樣器。儀器自帶Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

對(duì)照品沒食子酸和紅景天苷購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品所。超純水(Millipore，USA)，乙腈(色譜純，Merck)，甲酸為國(guó)產(chǎn)分析純。

在西藏那曲、山南和林芝等地區(qū)縣采集6個(gè)大花紅景天藥材，藥材具體采集地信息如下：1號(hào)為林芝米拉山、2號(hào)為林芝季拉山、3號(hào)為林芝朗縣、4號(hào)為林芝米林縣、5號(hào)為那曲縣、6號(hào)為山南桑日縣。經(jīng)西藏高原生物研究所李暉研究員鑒定，均為大花紅景天(Rhodiolacrenulata)。

樣品切片、陰干，用粉碎機(jī)粉碎，過50目篩，玻璃瓶?jī)?chǔ)裝備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 液相色譜條件

色譜柱為 Hypersil GOLD C18，100×2.1 mm，1.9 μm(Thermo公司)，柱溫35 ℃。流動(dòng)相φ=0.05%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脫，洗脫程序如下：0～1 min，2%B；1～8 min，2%～19.5%B；8～17 min，19.5%～35.5%B；17～20 min，35.5%～100%B；20～25 min，100%B。進(jìn)樣量為0.3 μL，流速為200 μL/min，分析時(shí)間25 min。

2.2 質(zhì)譜條件

電離源：- ESI，掃描范圍m/z100～1 000 u。離子源參數(shù)：噴霧電壓:-3 kV,汽化溫度:350 ℃;鞘氣壓力:30 arb;輔助氣壓力:5 arb;毛細(xì)管溫度:350 ℃;碰撞電壓：25 V。

2.3 樣品溶液的制備

精密稱取樣品粉末0.5 g置頂空瓶中，準(zhǔn)確加入甲醇10 mL，密塞。置恒溫箱中68 ℃加熱40 min后放置室溫冷卻，稱量用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液，過濾(5 μm)即得待測(cè)樣品溶液。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

取沒食子酸和紅景天苷對(duì)照品適量，分別以甲醇溶解備用。

3 結(jié) 果

3.1 大花紅景天樣品之間的總離子流圖比較

樣品的總離子流圖(TIC)如圖1所示。樣品大部分組分在25 min之前基本流出。從譜峰的數(shù)目、流出時(shí)間、譜峰的相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行分析，可以初步比較出樣品之間存在的相似以及差異的地方。

0～5 min時(shí)間段，出峰數(shù)目較少，tR=1.3 min 和3.0 min為主要的共同的譜峰。

5～13 min時(shí)間段，出峰數(shù)目比較多和集中，除了譜峰響應(yīng)值有差異以外，出峰的數(shù)目及其相對(duì)應(yīng)的流出時(shí)間基本接近。

13 min以后，樣品圖譜間的差異明顯，表現(xiàn)在13.5～15和18 min以后的時(shí)間段，2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)樣品有較強(qiáng)相應(yīng)的譜峰，而1號(hào)、5號(hào)和6號(hào)樣品在此區(qū)域則沒有響應(yīng)信號(hào)。

2號(hào)樣品出峰數(shù)目相對(duì)較多，其TIC圖如圖2。

3.2 大花紅景天的HPLC-ESI/MS分析及樣品之間化學(xué)成分的差異

紅景天苷、大花紅景天素、紅景天素、沒食子酸、黃酮及其糖苷等構(gòu)成紅景天的有效成分。本實(shí)驗(yàn)對(duì)質(zhì)譜圖中信號(hào)較強(qiáng)的譜峰通過其[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰及二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的碎片信息進(jìn)行了化合物的歸屬，同時(shí)比較了所歸屬化合物在6個(gè)樣品之間的差異，結(jié)果見表1。

圖1 大花紅景天樣品的總離子流質(zhì)譜圖(TIC)Fig.1 Total ion chromatograms (TIC) of Rhodiola crenulata

圖2 大花紅景天2號(hào)樣品的TIC圖Fig.2 TIC of No.2 Rhodiola crenulata

tR=3.0 min譜峰的基峰[M-H]-為m/z169，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的碎片有m/z125、97和79，與對(duì)照品沒食子酸的出峰時(shí)間、質(zhì)譜信息一致。有文獻(xiàn)報(bào)道[8],沒食子酸具有抗腫瘤、抗突變、抗氧化、抗乙肝病毒等生物學(xué)活性。1號(hào)、2號(hào)樣品中沒食子酸含量明顯高于其它樣品的量，其中5號(hào)樣品的量檢出最少。

紅景天苷是目前文獻(xiàn)和中國(guó)藥典中衡量大花紅景天質(zhì)量的主要指標(biāo)之一。紅景天苷對(duì)照品出峰時(shí)間在tR=7.5 min。樣品在相應(yīng)保留時(shí)間都有強(qiáng)度不一的譜峰，質(zhì)譜圖對(duì)應(yīng)m/z299的基峰,m/z299的二級(jí)碎片主要有m/z141、119，與對(duì)照品紅景天苷的質(zhì)譜信息一致。以紅景天苷的峰強(qiáng)度作為判斷指標(biāo)時(shí)，1號(hào)樣品的量最高，6號(hào)，3號(hào)，5號(hào)，4號(hào)，2號(hào)樣品的量依次減少，其中2號(hào)，4號(hào)，5號(hào)樣品的量基本接近。

大花紅景天素(相對(duì)分子質(zhì)量為480)和紅景天素(相對(duì)分子質(zhì)量為610)是大花紅景天植物中特征成分，后者屬于黃酮化合物，苷元為草質(zhì)素(3,5,7,8,4’-五羥基黃酮)。以大花紅景天素的[M-H]-m/z479為基峰判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)譜圖的選擇離子提取，得到1個(gè)峰(tR=20.4 min)，其二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生m/z300、299，271、255等主要碎片(圖3)，結(jié)合大花紅景天素的化學(xué)結(jié)構(gòu)[9]，這些二級(jí)質(zhì)譜碎片的和歸屬裂解途徑都能得到合理的解釋(圖3)，因此tR=20.4 min的峰被鑒定為大花紅景天素。在所分析的6個(gè)樣品中，2號(hào)樣品大花紅景天素明顯高于其它5個(gè)樣品。同樣，對(duì)紅景天素的[M-H]-m/z609進(jìn)行質(zhì)譜圖的選擇離子提取[1,10]，也得到tR=14.1 min的一個(gè)譜峰，其二級(jí)質(zhì)譜只產(chǎn)生m/z301的碎片(圖4)，對(duì)應(yīng)紅景天素母離子脫去二糖基后的黃酮苷元草質(zhì)素。在分析的6個(gè)樣品中，2號(hào)和4號(hào)含量均較高，5號(hào)和6號(hào)樣品幾乎未檢出。

圖3 大花紅景天素[M-H]-m/z 479的二級(jí)質(zhì)譜圖及其產(chǎn)生的二級(jí)質(zhì)譜碎片的可能歸屬Fig.3 MS2 of m/z 479, and its possible fragmentation pathway

圖4 紅景天素[M-H]- m/z 609的二級(jí)質(zhì)譜圖及其產(chǎn)生的二級(jí)質(zhì)譜碎片的可能歸屬Fig.4 MS2 of m/z 609, and its possible fragmentation pathway

除上述特征組分以外，山奈酚、草質(zhì)素及其糖苷化合物也構(gòu)成紅景天主要物質(zhì)組成[1,3,5,9-10]。黃酮苷化合物的電噴霧質(zhì)譜有明顯的質(zhì)譜特征，母離子的二級(jí)質(zhì)譜中糖苷鍵容易斷裂失去糖基得到信號(hào)非常強(qiáng)的苷元碎片信息，從丟失的碎片可以推測(cè)苷元上所連接的糖基，如失去162、146分別對(duì)應(yīng)于母離子失去一分子脫氧葡萄糖、一分子脫氧鼠李糖，失去308對(duì)應(yīng)于母離子失去蕓香糖苷。

山奈酚、槲皮素和草質(zhì)素的鼠李糖、葡萄糖苷均有文獻(xiàn)報(bào)道存在于紅景天藥材中[9,11-14]。在tR=14.0 min觀察到m/z463的基峰，它產(chǎn)生碎片中存在m/z301碎片，對(duì)應(yīng)黃酮苷母核槲皮素；tR=12.6、14.9和15.8 min分別觀察到m/z447、m/z593和m/z431的基峰，它們產(chǎn)生碎片中均存在非常強(qiáng)的m/z285碎片，對(duì)應(yīng)黃酮苷母核山奈酚。這些化合物從母離子到m/z301或m/z285的質(zhì)量丟失分別為162、308和146，可以推測(cè)tR=14.0 min的化合物為槲皮素-葡萄糖苷，12.6 min對(duì)應(yīng)化合物為山奈酚-葡萄糖苷，而14.9 min對(duì)應(yīng)的化合物為山奈酚-蕓香糖苷，tR=15.8 min的化合物為山奈酚-鼠李糖苷(表1、圖5)。山奈酚具有抗菌、抗氧化、止咳等多種功效，樣品中鑒定出山奈酚及其單糖、二糖苷的存在，但這些化合物在不同產(chǎn)地的紅景天樣品中的相對(duì)含量有明顯差異。

在tR=10.4和10.7 min有兩個(gè)強(qiáng)峰(圖6)，對(duì)應(yīng)[M-H]-m/z607和m/z445，兩者都有相同的碎片m/z299，從碎片丟失可以推測(cè)出前者是蕓香糖苷，后者是鼠李糖苷，苷元為甲氧基三羥基黃酮。

以上述已基本確定結(jié)構(gòu)化合物的各自峰面積占總出峰面積的百分比來表示這些化合物的相對(duì)含量，結(jié)果見表1。選取2號(hào)樣品，按2.1和2.2項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣3次，測(cè)定其中代表化合物紅景天苷的峰面積，結(jié)果顯示，其峰面積的RSD=8.61%，保留時(shí)間的RSD=0.34%。

圖 5 以山奈酚為母核的黃酮苷類化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.5 MS2 of flavonoid glycosides compounds of kaempferola:山奈酚-葡萄糖苷; b: 山奈酚-云香糖苷;c: 山奈酚-鼠李糖苷

編號(hào)tR/min[M?H]-MS2(basepeak/%)歸屬各批次樣品相對(duì)峰面積/%123456130169125(100)，97(20)，79(30)沒食子酸761666351313142213275299141(20)，119(85)紅景天苷7822013722502734513104607299(100)，271(15)甲氧基三羥基黃酮?蕓香苷0996283245550540484107445299(100)，271(30)，243(4)，215(6)甲氧基三羥基黃酮?鼠李糖苷1226292876180820625126447300(8)，285(100)，284(55)，271(9)，257(12)山奈酚?葡萄糖苷00903500006140463301(100)，300(18)，271(1)，255(1)槲皮素?葡萄糖苷01740470860110047141609301(100)紅景天素08011136241230330148145447301(100)，300(4)，273(2)草質(zhì)素?鼠李糖苷06091844115703509149593285(100)山奈酚?蕓香苷0130500200400010158431285(100)，284(65)，257(20)，151(18)山奈酚?鼠李糖苷07431812626500801111181285257(2)，229(4)，199(2)，151(2)，135(2)山奈酚141157826440801303012204479301(10)，300(45)，299(100)，271(40)，255(4)大花紅景天素077396139168027026

圖6 以甲氧基三羥基黃酮為母核的黃酮苷類化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 MS2 of flavonoid glycosides compounds of methoxy trihydroxy flavone a: 甲氧基三羥基黃酮-蕓香苷； b: 甲氧基三羥基黃酮-鼠李糖苷

4 結(jié) 論

本文采用了UPLC-ESI-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，對(duì)6個(gè)不同產(chǎn)地的大花紅景天的甲醇提取液進(jìn)行主要化學(xué)成分分析。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，西藏不同產(chǎn)地采集的紅景天藥材之間紅景天苷、大花紅景天素、沒食子酸、黃酮等主要的化學(xué)成分存在著差異。除了紅景天苷以外，其它化合物如黃酮苷類化合物均有一定的藥效，因而在開發(fā)西藏大花紅景天植物藥材是應(yīng)綜合考慮所含的有效化合物成分。

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