當(dāng)歸—川芎藥對(duì)不同制法與配比抗氧化活性相互作用研究

黃美艷，唐于平，尚爾鑫，郭建明，劉欣，王林艷，李偉霞，段金廒

[摘要] 目的：應(yīng)用響應(yīng)曲面分析法觀察歸芎藥對(duì)不同制法、不同配比對(duì)DPPH自由基清除率體外抗氧化活性的相互作用研究。方法：采用2，2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）自由基清除率法測(cè)定當(dāng)歸-川芎10個(gè)配比，3種不同提取方法的提取物的抗氧化活性，應(yīng)用非線性回歸的方法確定量效曲線的各個(gè)參數(shù)，建立三維響應(yīng)面模型，應(yīng)用Matlab軟件構(gòu)建響應(yīng)曲面的三維圖形。結(jié)果：不同配比不同制法的30個(gè)樣品，均具有明顯的清除自由基活性，且表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。水提液的協(xié)同作用范圍窄，幾乎成點(diǎn)狀分布，拮抗作用范圍呈6條寬窄不一的條帶狀分布；醇提液的協(xié)同作用呈小條狀分布，拮抗作用呈點(diǎn)狀分布。在先水提后醇提液協(xié)同作用呈條狀分布（3條），拮抗作用呈點(diǎn)狀分布。總之先水提后醇提液的協(xié)同作用區(qū)域大于醇提液，水提液次之；3種提取方法大部分區(qū)域均未表現(xiàn)出明顯協(xié)同與拮抗作用。結(jié)論：采用響應(yīng)曲面分析法定量研究中藥配伍藥物相互作用，為相關(guān)研究提供了思路與方法的參考。

[關(guān)鍵詞] 當(dāng)歸；川芎；藥對(duì)；抗氧化；DPPH；響應(yīng)曲面分析法；相互作用

中醫(yī)多以數(shù)味中藥配伍形成的方劑為載體治療疾病[1]。配伍是中藥用方的靈魂。藥有個(gè)性之特長(zhǎng)，方有合群之妙用，藥物的聯(lián)合使用才能產(chǎn)生藥物的相互作用，主要表現(xiàn)在效應(yīng)的強(qiáng)度、毒性以及作用時(shí)間上的一些變化。兩藥配伍后可產(chǎn)生相加性、協(xié)同性或拮抗性藥物相互作用[2]。研究方法有定性的輻射分析法、分?jǐn)?shù)分析法、概率分析法和定量的響應(yīng)曲面分析法等[3]。

當(dāng)歸-川芎為臨床常用藥對(duì)，歷史上許多著名的方劑均是由這2味藥物組成，歷代許多婦科良方如四物湯及其類方均含有這2味藥，但由于不同的配伍比例，使得這些方劑產(chǎn)生了不同的功效及臨床主治[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明歸芎藥對(duì)具有抗氧化作用[5-6]，氧自由基涉及歸芎所應(yīng)用的婦科、內(nèi)科以及養(yǎng)生等多個(gè)領(lǐng)域的病理機(jī)制。因此，實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作基礎(chǔ)上[7-17]，選擇對(duì)DPPH體外抗氧化模型的影響作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較當(dāng)歸和川芎10種配比（1∶0，1∶0.176，1∶0.364，1∶0.577，1∶0.839，1∶1.192，1∶1.732，1∶2.747，1∶5.67，0∶1）與3種提取方法（水提取模擬水煮，50%醇提取模擬酒水煎煮，先水提再95%醇提近似模擬散劑）的提取液的體外抗氧化活性差異，并采用響應(yīng)曲面分析法，研究當(dāng)歸-川芎體外抗氧化相互作用與量效關(guān)系，為揭示當(dāng)歸-川芎藥對(duì)的配伍用藥規(guī)律提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根，來(lái)源于甘肅岷縣當(dāng)歸GAP種植基地；川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，來(lái)源于四川彭州川芎GAP種植基地，并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝博士鑒定?；陧憫?yīng)曲面分析藥物相互作用要求，采用Short等[18]提出的輻射（radial slices）設(shè)計(jì)，將二維坐標(biāo)平均分成9等分，即得10個(gè)歸芎藥對(duì)配比（1∶0，1∶0.176，1∶0.364，1∶0.577，1∶0.839，1∶1.192，1∶1.732，1∶2.747，1∶5.67，0∶1）。對(duì)歸芎藥對(duì)不同配比混合藥材分別進(jìn)行熱回流水提取、熱回流50%醇提取和先水提再用95%醇提，得到相應(yīng)樣品（W-1～W-10，A-1～A-10，WA-1～WA-10），冷藏備用。DPPH（2，2-二苯基-1-苦肼基）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 A-5002酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）；FA1104N精密天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；EPED-T型超純水器（南京易普易達(dá)科技有限公司）。

1.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定法 DPPH清除率的測(cè)定[19]，在96孔板中加入不同提取方法不同配比不同濃度的歸芎藥對(duì)100 μL，終濃度含生藥量分別為0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16 g·L^-1。加入各樣品受試藥物后，溶于含0.1 g·L^-1 DPPH的100 μL無(wú)水乙醇溶液，避光反應(yīng)30 min后在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度為A0。同時(shí)作空白對(duì)照，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度為A₁。為扣除藥物本底顏色對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，在加入藥物后加入無(wú)水乙醇在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度A2。每個(gè)樣品重復(fù)6次，按照下式計(jì)算各樣品受試藥物對(duì)DPPH清除率：A₁-（A₀-A₂）/A₁×100%，并計(jì)算IC₅₀（指DPPH的抑制率為50%時(shí)的提取物溶液濃度），IC₅₀越小，抗氧化活性越高。

2 結(jié)果

2.1 歸芎藥對(duì)不同比例、不同提取方法的IC₅₀ 不同比例、不同制備方法得到的樣品抗氧化能力有所不同。其中，水提液1∶1.192配比最優(yōu)，1∶0，0∶1配比效果最差；醇提液1∶5.67配比最優(yōu)，1∶0配比效果最差；先水提后醇提1∶5.67配比最優(yōu)，1∶1.73配比效果最差，見(jiàn)表1。

2.2 模型參數(shù)加合構(gòu)建響應(yīng)曲面 本研究應(yīng)用響應(yīng)曲面分析法探討當(dāng)歸-川芎藥對(duì)對(duì)DPPH自由基的抗氧化作用的藥效學(xué)相互作用規(guī)律。由于中藥中多成分多靶點(diǎn)的共同作用，本文研究中采用二次多項(xiàng)式來(lái)更好的描述兩藥合用的量效曲線，并以合并指數(shù)來(lái)描述兩藥的相互作用強(qiáng)度。為了便于繪圖，將合并指數(shù)減1，以0作為典型的加和作用。

根據(jù)結(jié)果得出不同提取方法不同配比當(dāng)歸-川芎的IC₅₀，求算出U_DG和U_CX （U_DG=當(dāng)歸實(shí)際用量/IC₅₀，DG；U_CX=川芎實(shí)際用量/IC₅₀，CX），U_DG +U_CX=U，以U/ IC₅₀（不同配比）為橫坐標(biāo)，E_清除率表示不同濃度的清除率，以E_清除率/（1-E_清除率）為縱坐標(biāo)，應(yīng)用非線性回歸的方法確定量效曲線的各個(gè)參數(shù)，見(jiàn)表1，方程為y=ax^b，建立三維響應(yīng)面模型，應(yīng)用Matlab軟件構(gòu)建響應(yīng)曲面的三維圖形。

2.3 當(dāng)歸-川芎藥對(duì)相互作用的評(píng)價(jià) 在三維響應(yīng)面模型中，顏色的深淺代表了該點(diǎn)處2藥相互作用的強(qiáng)度。根據(jù)合并指數(shù)的計(jì)算方法，當(dāng)指數(shù)接近于0時(shí)，提示藥物間為相加作用；大于1時(shí)，提示藥物間為拮抗作用，小于1時(shí)為協(xié)同作用。指數(shù)值越高，表示相互作用的強(qiáng)度越大，在圖中表現(xiàn)為顏色越接近于紅或藍(lán)兩端。X軸表示不同劑量濃度的U_{當(dāng)歸}（U_{當(dāng)歸}=當(dāng)歸實(shí)際用量/IC₅₀，_DG），Y軸表示不同劑量濃度的U川芎（U川芎=川芎實(shí)際用量/IC₅₀，_CX），Z軸表示歸芎藥對(duì)在不同劑量下的清除率，由X，Y，Z軸形成的三維空間區(qū)域表示不同比例當(dāng)歸-川芎藥對(duì)的效應(yīng)值形成的曲面圖（局部截面圖中參數(shù)所代表的是U_{當(dāng)歸}，U川芎，效應(yīng)值強(qiáng)度，相互作用強(qiáng)度）。

2.4 歸芎藥對(duì)水提液的相互作用 在歸芎藥對(duì)水提液的響應(yīng)曲面圖1中A，協(xié)同作用范圍窄，幾乎成散點(diǎn)狀分布，拮抗作用成條狀分布，約6條，寬窄不一，大部分均未表現(xiàn)出明顯協(xié)同與拮抗作用。圖1中B（0.10，0.30，0.44，-1.00）的點(diǎn)作為協(xié)同作用最強(qiáng)的點(diǎn)，得質(zhì)量濃度為0.59 g·L^-1，配比為1∶1.44。圖1中C（1.00，20.00，0.76，1.00）的點(diǎn)作為拮抗作用最強(qiáng)的點(diǎn)，得質(zhì)量濃度為26.82 g·L^-1，歸芎配比為1∶9.56。

2.5 歸芎藥對(duì)醇提液的相互作用研究 在歸芎藥對(duì)醇提液的響應(yīng)曲面圖2中A，協(xié)同作用呈小條狀分布，拮抗作用呈散點(diǎn)分布，而超過(guò)90%均未表現(xiàn)出明顯協(xié)同與拮抗作用。圖2中B（0.01，0.10，0.31，-1.00）的點(diǎn)作為協(xié)同作用最強(qiáng)的點(diǎn)，得質(zhì)量濃度為0.12 g·L^-1，配比為1∶2。圖2中C（0.40，0.10，0.80，1.00）的點(diǎn)作為拮抗作用最強(qiáng)的點(diǎn)，得質(zhì)量濃度為1.64 g·L^-1，歸芎配比為22.42∶1。

2.6 歸芎藥對(duì)先水提后醇提的相互作用研究 在歸芎藥對(duì)先水提后醇提液的響應(yīng)曲面圖3中A，協(xié)同作用呈小條狀分布，有3條，拮抗作用呈散點(diǎn)分布，而超過(guò)50%均未表現(xiàn)出明顯協(xié)同與拮抗作用。圖3中B（0.10，1.70，0.62，-1.00）的點(diǎn)作為協(xié)同作用最強(qiáng)的點(diǎn)，得質(zhì)量濃度為2 g·L^-1，配比為1∶10.76。圖3中C（0.2，0.10，0.12，1.00）的點(diǎn)作為拮抗作用最強(qiáng)的點(diǎn)，得質(zhì)量濃度為0.45 g·L^-1，歸芎配比為1∶0.32。

3 討論

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，癌癥、糖尿病、心腦血管等多種疾病與自由基導(dǎo)致的生物大分子氧化損傷有關(guān)。自由基是人體進(jìn)行生命活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的一種活性分子，在正常代謝過(guò)程中，自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，在某些病理情況下，這種平衡被打破，機(jī)體產(chǎn)生的自由基不能被及時(shí)消除，致使機(jī)體損傷，導(dǎo)致疾病發(fā)生。DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可見(jiàn)光區(qū)最大吸收峰為517 nm，當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時(shí)，孤對(duì)電子被配對(duì)，吸收減弱或消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，可用來(lái)檢測(cè)自由基的清除情況，評(píng)價(jià)某物質(zhì)的抗氧化能力。其能力用清除率來(lái)表示，清除率越大，表示抗氧化能力越強(qiáng)[20]。本實(shí)驗(yàn)采用DPPH法考察不同配比不同濃度不同提取方法的歸芎藥對(duì)抗氧化能力，然后應(yīng)用非線性回歸的方法確定量效曲線的各個(gè)參數(shù)，建立三維響應(yīng)面模型，應(yīng)用Matlab軟件構(gòu)建響應(yīng)曲面的三維圖形。

結(jié)果顯示，當(dāng)歸-川芎不同配比不同制法具有不同的抗氧化活性。通過(guò)分析響應(yīng)曲面發(fā)現(xiàn)先水提后醇提的協(xié)同作用區(qū)域大于醇提液，水提液次之，可能是由于當(dāng)歸-川芎合并先水提后醇提能使更多抗氧化成分溶出增加。

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Study on antioxidant interaction of different preparations and

proportions of Danggui-Chuanxiong drug pair

HUANG Mei-yan， TANG Yu-ping*， SHANG Er-xin， GUO Jian-ming， LIU Xin，

WANG Lin-yan， LI Wei-xia， DUAN Jin-ao

（Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of Traditional Chinese Medicine Formulae，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210046， China）

[Abstract] Objective： To observe the in vitro antioxidant interaction of different preparations and proportions of Danggui-Chuanxiong drug pair in the DPPH free radical scavenging rate with the response surface methodology. Method： The 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl （DPPH） free radical scavenging rate method was adopted for determining the antioxidant activity of extracts from Danggui-Chuanxiong with 10 proportions and three extraction processes. The response surface methodology was used to determine the parameters of the dose-effect curve and establish a three-dimensional response surface model. The three-dimensional response surface graph was constructed with Matlab software. Result： All of the 30 samples with different proportions and preparations had antioxidant effect in scavenging free radicals and a remarkable dose-effect relationship. Their water extracts had a narrow synergistic range， with only spot distribution. Their antagonist ranges were districted in six bands of various widths. The synergistic ranges of ethanol extracts were districted in small bands， with the antagonist ranges scattered in points. The synergistic ranges of their water-alcohol extracts were distributed in three bands， with their antagonist ranges scattered in points. In short， the water-alcohol extracts showed a wider synergistic range than ethanol extracts， followed by water-extracts. All of the three extraction processes showed no obvious synergistic and antagonist effects. Conclusion： The quantitative study on the interaction of traditional Chinese medicines with different compatibilities with the response surface methodology provides reference of thoughts and methods for relevant studies.

[Key words] Danggui； Chuanxiong； drug pair； antioxidant effect； DPPH； response surface methodology； interaction

doi：10.4268/cjcmm20130218

[責(zé)任編輯 張寧寧]