中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則

陳士林，姚輝，韓建萍，辛天怡，龐曉慧，石林春，羅焜，宋經(jīng)元，侯典云，石上梅，錢(qián)忠直

摘要] 隨著中藥材DNA條形碼分子鑒定方法研究的深入與普及，國(guó)家藥典委員會(huì)討論通過(guò)在《中國(guó)藥典》增補(bǔ)本中列入中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則，該指導(dǎo)原則通過(guò)對(duì)大樣本量中藥材進(jìn)行DNA條形碼分子鑒定研究，建立以ITS2為核心，psbA-trnH為輔的植物類(lèi)藥材DNA條形碼鑒定體系和以COI為主、ITS2為輔的動(dòng)物類(lèi)藥材DNA條形碼鑒定體系。該文介紹了中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則及其起草說(shuō)明，并對(duì)該原則在中藥材鑒定方面的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

[關(guān)鍵詞] 中國(guó)藥典； 中藥材；DNA條形碼；分子鑒定；指導(dǎo)原則

歷代本草記載的差異，以及不同醫(yī)學(xué)流派在傳承過(guò)程中產(chǎn)生的異化使得中藥存在同名異物、同物異名等現(xiàn)象；部分藥材由于歷史的沿革，品種產(chǎn)生變遷，形成多基原藥材同用現(xiàn)象；此外，因正品藥材短缺難以滿足市場(chǎng)需求，民間常用其他類(lèi)似品種取而代之，代用品、習(xí)用品的隨意使用使得中藥材品種復(fù)雜混亂的情勢(shì)加劇。由于傳統(tǒng)的性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定在中藥材的物種鑒定上有著一定的局限性，為了保證中藥材臨床應(yīng)用準(zhǔn)確、安全、有效，有必要在現(xiàn)有鑒定方法的基礎(chǔ)上增加中藥材DNA條形碼分子鑒定。隨著中藥材DNA條形碼分子鑒定方法研究的深入與普及，國(guó)家藥典委員會(huì)討論通過(guò)在《中國(guó)藥典》增補(bǔ)本中列入中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則，該指導(dǎo)原則通過(guò)對(duì)大樣本量中藥材進(jìn)行DNA條形碼分子鑒定研究，建立以ITS2為核心，psbA-trnH為輔的植物類(lèi)藥材DNA條形碼鑒定體系和以COI為主、ITS2為輔的動(dòng)物類(lèi)藥材DNA條形碼鑒定體系。本文介紹了中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則及其起草說(shuō)明，并對(duì)該原則在中藥材鑒定方面的應(yīng)用前景進(jìn)行展望，為中藥材準(zhǔn)確、可靠鑒定及臨床用藥安全提供新的技術(shù)手段。

1 中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則

1.1 定義及原理

DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA序列來(lái)進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)，是傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法的有效補(bǔ)充。由于DNA序列是由腺嘌呤（A）、鳥(niǎo)嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）4種堿基以不同順序排列組成，因此一定長(zhǎng)度DNA序列能夠區(qū)分不同物種。

中藥材DNA條形碼分子鑒定是以ITS2為主體條形碼序列鑒定中藥材的方法體系，其中植物類(lèi)中藥材選用ITS2為主體序列，psbA-trnH為輔助序列，動(dòng)物類(lèi)中藥材采用COI為主體序列，ITS2為輔助序列，符合中藥材鑒定簡(jiǎn)單、精確的特點(diǎn)，有明確的判斷標(biāo)準(zhǔn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)中藥材及其基原物種的準(zhǔn)確鑒定。本指導(dǎo)原則用于規(guī)范中藥材DNA條形碼分子鑒定法，為其應(yīng)用提供指導(dǎo)。

該鑒定方法主要適用于中藥材（包括藥材、藥材粉末及部分藥材飲片）及基原物種的鑒定。

1.2 方法流程

中藥材DNA條形碼分子鑒定法主要包括供試品處理、DNA提取、PCR擴(kuò)增、測(cè)序、序列拼接及結(jié)果判定，以下內(nèi)容詳細(xì)說(shuō)明各流程中的主要原理及注意事項(xiàng)。

1.2.1 供試品處理 除特殊標(biāo)明外，藥材使用75%乙醇擦洗表面后晾干，稱取10～100 Mg²⁺備用。

1.2.2 DNA提取 DNA的提取包括破碎細(xì)胞壁、釋放DNA，DNA的分離和純化，DNA的濃縮、沉淀與洗滌等基本步驟，目前常用試劑盒法，包括植物基因組DNA提取試劑盒和動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒。

由于植物類(lèi)中藥材種類(lèi)繁多，可根據(jù)所研究中藥材的具體情況對(duì)提取方法加以改進(jìn)。植物細(xì)胞內(nèi)含有大量次生代謝產(chǎn)物，如多糖、多酚等，這些物質(zhì)在提取DNA的過(guò)程中與DNA共沉淀，形成黏稠的膠狀物難以溶解或產(chǎn)生褐變，嚴(yán)重影響DNA提取的產(chǎn)量與質(zhì)量，以及后續(xù)的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。β-巰基乙醇是抗氧化劑，在提取DNA過(guò)程中加入β-巰基乙醇，可以抑制氧化反應(yīng)，避免褐化。PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA提取過(guò)程中多酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。因此將PVP和β-巰基乙醇配合使用，能夠有效地防止DNA提取過(guò)程中多酚及多糖的污染。EDTA（乙二胺四乙酸）螯合Mg²⁺2+或Mn²⁺，抑制DNase（DNA酶）活性；CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽(yáng)離子表面活性劑，可溶解細(xì)胞膜，與DNA形成復(fù)合物溶于高鹽溶液，降低溶液鹽濃度至一定程度，則從溶液中沉淀，經(jīng)離心即可將CTAB與DNA復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類(lèi)物質(zhì)分開(kāi)。三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl） （pH 8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止DNA被破壞。

根、根莖、莖木類(lèi)、皮類(lèi) 通常根和根莖組織中多酚、多糖含量高，在研磨時(shí)多酚極易氧化成醌類(lèi)，在純化過(guò)程中很難去除，使DNA帶有一定顏色，影響后續(xù)的PCR反應(yīng)，所以在提取根及根莖類(lèi)藥材DNA時(shí)一定要注意多糖、多酚的去除。提取根及根莖類(lèi)藥材DNA時(shí)水浴時(shí)間一般為90 min，對(duì)于質(zhì)地堅(jiān)硬的根及根莖類(lèi)和莖木類(lèi)藥材，可以采用延長(zhǎng)水浴時(shí)間，如56 ℃水浴過(guò)夜，使得DNA充分釋放到緩沖溶液中。此外，根莖類(lèi)藥材由于富含纖維和貯藏物質(zhì)，需較多樣品量才能提取到足量DNA，可用大體積離心管（5 mL或15 mL）抽提。皮類(lèi)中藥材組織中富含薄壁組織和纖維等，加液氮不易研磨成細(xì)粉，需適當(dāng)增加樣品量，同時(shí)應(yīng)增加β-巰基乙醇和PVP的使用量。

葉、花、全草類(lèi) 該類(lèi)藥材采用試劑盒一般都能成功提取其DNA，對(duì)于保存時(shí)間較久的葉、花、全草類(lèi)藥材可適當(dāng)增加水浴時(shí)間，同時(shí)適當(dāng)降低水浴溫度，如56 ℃水浴過(guò)夜等。

果實(shí)、種子類(lèi) 果實(shí)及種子類(lèi)中藥材中多富含油脂，研磨時(shí)易被氧化，且易粘著在研缽壁上，損失較大，提取時(shí)需增加樣品量。另外，對(duì)研磨后的材料可用丙酮浸提，去除脂溶性酚類(lèi)化合物。

動(dòng)物藥材 常用基于SDS（十二烷基硫酸鈉）原理的試劑盒法提取DNA。SDS是一種陰離子表面活性劑，在55～65 ℃條件下能裂解細(xì)胞，釋放出核酸。對(duì)肌肉類(lèi)動(dòng)物藥材如海龍、蛇類(lèi)、蛤蚧等，需進(jìn)行紫外殺菌處理，并且需要充分磨碎；含有脂類(lèi)較多的動(dòng)物內(nèi)臟器官如蛤蟆油，先用不含蛋白酶K和SDS的緩沖液浸泡藥材，然后在試劑盒消化緩沖液中增加SDS含量，有利于脫去脂類(lèi)；骨甲類(lèi)藥材如龜甲、鱉甲和鹿茸等，由于DNA含量較低，樣品量要適當(dāng)增大，也可用大體積離心管（5 mL或15 mL）抽提。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 植物類(lèi)中藥材及其基原物種擴(kuò)增ITS2或psbA-trnH序列，動(dòng)物類(lèi)中藥材及其基原物種擴(kuò)增COI序列，通用引物及擴(kuò)增條件如下，具體如有改變見(jiàn)各藥材項(xiàng)下。

ITS2序列擴(kuò)增正向引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；反向引物ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。psbA-trnH序列擴(kuò)增正向引物psbAF：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；反向引物trnHR：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。COI序列擴(kuò)增正向引物HCO2198：5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；反向引物L(fēng)CO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′。

PCR反應(yīng)體系以25 μL為參照，包括 1× PCR緩沖液（不含Mg²⁺Cl₂），2.0 mmol·L^-1 Mg²⁺Cl₂，0.2 mmol·L^-1 dNTPs，0.1 mmol·L^-1引物對(duì)，模板DNA，1.0 U Taq DNA聚合酶，加滅菌雙蒸水至25 μL。設(shè)置未加模板DNA的PCR反應(yīng)為陰性對(duì)照。

ITS2序列擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。psbA-trnH序列擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。COI序列擴(kuò)增程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1.5 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè) 采取瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)PCR產(chǎn)物。電泳后，PCR產(chǎn)物應(yīng)在相應(yīng)的DNA條形碼序列長(zhǎng)度位置出現(xiàn)一條目的條帶，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)條帶。

1.2.5 測(cè)序 有PCR擴(kuò)增條帶的樣品送測(cè)序公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。使用DNA測(cè)序儀對(duì)目的條帶進(jìn)行雙向測(cè)序，PCR擴(kuò)增引物作為測(cè)序引物，測(cè)序原理同Sanger測(cè)序法。

1.2.6 中藥材DNA條形碼序列獲得 主要包括序列拼接和序列質(zhì)量與方向2個(gè)方面的內(nèi)容。對(duì)雙向測(cè)序峰圖應(yīng)用專(zhuān)業(yè)軟件進(jìn)行序列拼接，去除引物區(qū)，獲得相應(yīng)的DNA序列。為確保DNA條形碼序列的可靠性，需對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，去除測(cè)序結(jié)果兩端的低質(zhì)量序列。序列方向應(yīng)與PCR擴(kuò)增正向引物方向一致。

1.2.7 結(jié)果判定 將獲得的序列在中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http：//www.tcmbarcode.cn）或GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中應(yīng)用BLAST（basic local alignment search tool）方法進(jìn)行結(jié)果判定，結(jié)果中相似性最高的序列對(duì)應(yīng)物種為查詢序列最接近的物種。如果植物類(lèi)藥材ITS2序列比對(duì)后最接近的物種為真菌，則需采用psbA-trnH序列重復(fù)上述方法流程。中藥材DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)及GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST鑒定系統(tǒng)操作流程見(jiàn)下。

登錄中藥材DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)網(wǎng)站，在主頁(yè)點(diǎn)擊“物種鑒定”。根據(jù)需鑒定物種的種類(lèi)，選擇對(duì)應(yīng)的鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)，如點(diǎn)擊植物類(lèi)藥材鑒定（ITS/ITS2）。將需要鑒定的物種序列復(fù)制后粘貼到“植物類(lèi)藥材鑒定（ITS/ITS2）”的序列輸入欄，點(diǎn)擊“提交”按鈕，進(jìn)行BLAST鑒定。在BLAST比對(duì)結(jié)果中，在“序列比對(duì)信息”欄查看相關(guān)比對(duì)信息，在“物種鑒定結(jié)果”欄顯示與所查詢序列最接近的物種。

登錄GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST鑒定系統(tǒng)（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），在Basic BLAST中選擇nucleotide blast，在Enter Query Sequence中粘貼需要鑒定的序列（Query）（建議用fasta格式）。在Choose Search Set中選others（nr etc.）數(shù)據(jù)庫(kù)，點(diǎn)擊左下角BLAST。在BLAST結(jié)果中查看序列相似性最高（max ident）的物種，一般為與查詢序列最接近的物種。

1.3 中藥材DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建原則

建立中藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，應(yīng)在藥材原產(chǎn)地及主產(chǎn)地采集供試品，采用經(jīng)典分類(lèi)方法確定其基原，采集樣本盡可能覆蓋其分布區(qū)，每個(gè)物種采集來(lái)自不同產(chǎn)地樣本20份以上。根據(jù)具體藥材測(cè)定ITS2或psbA-trnH或COI等DNA條形碼序列，分析確定該藥材DNA條形碼序列種內(nèi)變異大小。對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得或GenBank中的中藥材DNA條形碼序列必須經(jīng)過(guò)核準(zhǔn)后方可錄入中藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)需定期對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行更新。

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.4.1 影響因素考察 考察DNA條形碼分子鑒定法的影響因素，包括DNA提取（樣品量、水浴溫度和水浴時(shí)間）、PCR條件（變性時(shí)間、退火溫度與時(shí)間及延伸時(shí)間）及產(chǎn)物純化（考察不同純化試劑盒），保證實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性。

1.4.2 精密度考察 主要分為重復(fù)性考察、中間精密度考察及重現(xiàn)性考察。

重復(fù)性，至少用3批供試品，每批3次或同批供試品進(jìn)行6次測(cè)定試驗(yàn)后對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定應(yīng)基本一致。

中間精密度，考察實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部條件改變（如不同人員、不同儀器、不同工作日和實(shí)驗(yàn)時(shí)間）對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，至少應(yīng)對(duì)同實(shí)驗(yàn)室不同操作人員的結(jié)果進(jìn)行考察。

重現(xiàn)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在3家以上實(shí)驗(yàn)室能夠重現(xiàn)，相同樣品在不同實(shí)驗(yàn)室獲得DNA條形碼序列應(yīng)相同。

1.4.3 方法適用性考察 采用DNA條形碼分子鑒定法對(duì)20批次以上藥材或基原物種進(jìn)行測(cè)定，積累數(shù)據(jù)，確定種內(nèi)序列變異大小，保證該測(cè)定方法的適用性。

1.4.4 基原物種對(duì)比驗(yàn)證 以分類(lèi)學(xué)家確認(rèn)的基原物種葉片為對(duì)象，采用該方法獲得DNA條形碼數(shù)據(jù)，與相應(yīng)藥材產(chǎn)生的DNA條形碼數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，避免內(nèi)生真菌等污染，保證結(jié)果準(zhǔn)確性。

1.5 注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所應(yīng)具備分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基本條件。

為防止外源真菌污染，實(shí)驗(yàn)前須將實(shí)驗(yàn)用具進(jìn)行高壓滅菌，并用75%乙醇擦洗藥材表面。有些藥材本身含有內(nèi)生真菌，如果內(nèi)生真菌存在于藥材的外圍組織，則選用內(nèi)部組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果真菌遍布整個(gè)藥材，植物類(lèi)藥材需選用psbA-trnH條形碼（真菌內(nèi)不含有該基因片段），不能選用ITS2序列。為進(jìn)一步確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果不被真菌污染，研究者可參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)辨別是否為真菌序列。

中藥材DNA條形碼分子鑒定法不用于確定藥用部位，暫不用于混合物及炮制品的鑒定。DNA條形碼分子鑒定是利用通用DNA序列來(lái)進(jìn)行物種鑒定，因此該方法可鑒定藥材的基原物種，而不能確定藥用部位。

種內(nèi)閾值的確定。同一物種的不同樣品間存在一定的變異范圍，即種內(nèi)變異閾值。不同物種，不同條形碼序列均會(huì)影響種內(nèi)變異范圍。各基原物種的種內(nèi)變異范圍（種內(nèi)遺傳距離閾值）會(huì)在藥材品種中具體明確。

2 中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則起草說(shuō)明

中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則在大量實(shí)驗(yàn)樣本基礎(chǔ)上形成，實(shí)驗(yàn)涉及的樣本量如下。

在2 373份藥材樣品中進(jìn)行了DNA提取和DNA條形碼序列ITS/ITS2及psbA-trnH的PCR擴(kuò)增，其中包括根及根莖類(lèi)藥材381個(gè)樣品（來(lái)自26科47屬58種），全草類(lèi)藥材1 679個(gè)樣品（來(lái)自142科482屬912種），花類(lèi)藥材70個(gè)樣品（來(lái)自10科16屬22種），莖木類(lèi)藥材52個(gè)樣品（來(lái)自16科20屬24種），果實(shí)類(lèi)藥材90個(gè)樣品（來(lái)自16科20屬33種），種子類(lèi)藥材18個(gè)樣品（來(lái)自8科11屬11種），皮類(lèi)藥材20個(gè)樣品（來(lái)自6科6屬6種），真菌類(lèi)藥材63個(gè)樣品（來(lái)自3科3屬4種）。

中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則用于規(guī)范中藥材DNA條形碼分子鑒定法，為其應(yīng)用提供指導(dǎo)。中藥材DNA條形碼分子鑒定法主要包括核心條形碼序列選擇、DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳、測(cè)序、序列拼接及結(jié)果判定等步驟。中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則起草說(shuō)明具體如下。

2.1 中藥材DNA條形碼分子鑒定核心序列選擇依據(jù)

2.1.1 植物類(lèi)中藥材ITS2和psbA-trnH條形碼的選擇依據(jù) DNA條形碼研究的首要任務(wù)是確定通用DNA條形碼序列。在植物界，研究者主要從葉綠體基因組和核基因組中尋找理想的DNA條形碼，曾提出諸多候選條形碼序列或組合[1-9]。2009年，國(guó)際條形碼協(xié)會(huì)植物工作組對(duì)來(lái)自550個(gè)物種907個(gè)樣品的7個(gè)序列（rbcL，matK，rpoC1，ropB，psbA-trnH，psbK-psbI，atpF-atpH）進(jìn)行了分析比較，建議將rbcL+matK組合作為植物通用條形碼[10]。然而，植物工作組認(rèn)為該組合還遠(yuǎn)不夠完美，尋找植物DNA條形碼的工作還沒(méi)有結(jié)束[11]。同年，在墨西哥召開(kāi)的第三屆國(guó)際條形碼大會(huì)上，與會(huì)代表一致認(rèn)為應(yīng)對(duì)ITS/ITS2和psbA-trnH序列進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。

2010年，陳士林等[12]分析比較了7個(gè)候選DNA條形碼（psbA-trnH， matK， rbcL， rpoC1， ycf5， ITS2， ITS）。研究對(duì)象為藥用植物及其密切相關(guān)物種。研究結(jié)果表明ITS2表現(xiàn)突出，在物種水平的鑒定效率高達(dá)92.7%。因此，陳士林等建議將ITS2作為藥用植物標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼。鑒于研究中psbA-trnH僅次于ITS2序列，也具有較好鑒定能力，因而推薦其作為ITS2的輔助條形碼。Yao等[13]基于大樣本量分析證實(shí)ITS2序列可以作為植物物種鑒別的通用條形碼，并以ITS2序列為基礎(chǔ)初步建立了藥用植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)絡(luò)查詢系統(tǒng)（http：//its2-plantidit.dnsalias.org/）。2011年，中國(guó)植物條形碼工作組（Chinese Plant BOL Group） 對(duì)來(lái)自42目75科141屬1 757物種的6 286樣本的rbcL，matK，psbA-trnH，ITS序列進(jìn)行研究，其結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了ITS2的鑒定能力，建議ITS/ITS2應(yīng)成為種子植物的核心條形碼，當(dāng)ITS難以擴(kuò)增和測(cè)序時(shí)，ITS2可以有效地彌補(bǔ)該缺陷[14]。陳士林等[15]提出建立以ITS2為核心、psbA-trnH為補(bǔ)充序列的植物類(lèi)藥材DNA條形碼鑒定體系。

2.1.2 動(dòng)物類(lèi)中藥材COI和ITS2條形碼的選擇依據(jù) 在動(dòng)物界，Herbert等于2003年首次提出將一段長(zhǎng)度約為650 bp的COI基因序列作為動(dòng)物條形碼鑒定的基礎(chǔ)片段[16]。同年，Herbert等[17]對(duì)11門(mén)13 320個(gè)物種的線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I （cytochrome c oxidase subunit I， COI）基因序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明所研究物種的種間遺傳距離在0.0%～53.7%，物種種間遺傳距離平均可達(dá)到11.3%，79%的物種種間遺傳距離均大于8%。以上研究結(jié)果進(jìn)一步支撐了前期的結(jié)論。隨后，COI基因特定片段的鑒定能力在鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、節(jié)肢動(dòng)物、哺乳動(dòng)物等具體動(dòng)物類(lèi)群的鑒定研究中均獲得了印證，因此研究者一致建議將COI序列作為動(dòng)物的通用條形碼[18-27]。

2010年，陳士林等[12]推薦將ITS2作為藥用植物通用條形碼，同時(shí)研究表明ITS2序列在動(dòng)物鑒定中也有較好表現(xiàn)[28-30]。為進(jìn)一步評(píng)估ITS2序列對(duì)動(dòng)物物種的鑒定能力，Yao等[13]對(duì)GenBank中12 221條動(dòng)物ITS2序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明ITS2序列在物種水平和屬水平的鑒定成功率分別為91.7%，99.7%。此外，研究表明ITS2序列對(duì)動(dòng)物密切相關(guān)物種也具有較高的鑒定能力，COI序列能夠成功鑒定大多數(shù)動(dòng)物類(lèi)群，但刺胞動(dòng)物[17]、West Palaearctic Pandasyopthalmus[31]等動(dòng)物類(lèi)群的COI基因序列變異性小或不變。而且線粒體DNA是母系遺傳，應(yīng)用其進(jìn)行物種鑒定時(shí)應(yīng)考慮核DNA，形態(tài)或生態(tài)特征[32]等方面的數(shù)據(jù)。Yao等基于較大樣本量的研究表明ITS2序列對(duì)動(dòng)物物種的鑒定成功率高達(dá)91.7%，且在刺胞動(dòng)物中的鑒定成功率大于77%，鑒于ITS2對(duì)動(dòng)物具有較高的鑒定能力，Yao等建議將其作為COI序列的輔助序列對(duì)動(dòng)物物種進(jìn)行鑒定[13]。

基于大量前期研究結(jié)果[12，33-50]，中藥材DNA條形碼分子鑒定法選用ITS2和psbA-trnH作為植物類(lèi)藥材的核心條形碼，COI和ITS2作為動(dòng)物類(lèi)中藥材的核心條形碼。

2.2 中藥材DNA 提取方法的確定

2.2.1 植物基因組DNA提取方法的確定依據(jù) 植物基因組DNA提取方法較多，常用基于CTAB原理的試劑盒法和改良的CTAB法[51]。應(yīng)用不同公司植物基因組DNA提取試劑盒等提取中藥材基因組DNA，結(jié)果表明試劑盒法適用于中藥材基因組DNA的提取。由于中藥材所含成分復(fù)雜，可針對(duì)不同入藥部位改進(jìn)DNA提取試劑盒方法[52]。

常用液氮研磨和球磨儀（鋼珠法）法來(lái)粉碎樣品，液氮研磨的優(yōu)點(diǎn)是保持低溫狀態(tài)，防止DNA降解，缺點(diǎn)是耗時(shí)且在樣品種類(lèi)較多時(shí)，容易產(chǎn)生交叉污染。球磨儀的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)粉碎多份樣品，有效避免樣品間的污染。

針對(duì)根及根莖、花、果實(shí)、種子和皮類(lèi)等藥材質(zhì)地，確定各自合適的樣品量。通過(guò)對(duì)2 373份藥材樣品的DNA提取實(shí)驗(yàn)，葉類(lèi)、花類(lèi)藥材取樣量約10～20 Mg²⁺，根類(lèi)、果實(shí)類(lèi)、種子類(lèi)、皮類(lèi)藥材約20～40 Mg²⁺。某些藥材需要增加樣品量，如沉香藥材DNA提取時(shí)取樣量為80 Mg²⁺。因此，通過(guò)對(duì)大量樣品DNA提取的研究，確定中藥材DNA條形碼鑒定法取樣量為10～100 Mg²⁺。

通過(guò)對(duì)不同入藥部位實(shí)驗(yàn)不同水浴時(shí)間梯度（20，30，40，50，60 min，3 h及水浴過(guò)夜），發(fā)現(xiàn)葉類(lèi)藥材水浴時(shí)間一般在20～40 min，根類(lèi)藥材在60 min～3 h，一些質(zhì)地堅(jiān)硬的藥材可56 ℃水浴過(guò)夜。

2.2.2 動(dòng)物類(lèi)藥材DNA提取方法的確定依據(jù) 動(dòng)物基因組DNA的提取采用血液/細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒。采用天根生化科技（北京）有限公司的血液/細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒（基于SDS法原理）提取動(dòng)物藥材的DNA，結(jié)果表明試劑盒法適用于動(dòng)物基因組DNA的提取，根據(jù)動(dòng)物藥材藥用部位的不同（肌肉、角甲、殼類(lèi)），選用不用的DNA提取試劑盒。

動(dòng)物類(lèi)藥材DNA提取前，應(yīng)針對(duì)不同取樣部位對(duì)樣品進(jìn)行不同的前期處理。肌肉類(lèi)動(dòng)物藥材需進(jìn)行紫外殺菌處理并充分搗碎；骨甲類(lèi)藥材由于DNA含量稍少，應(yīng)適量增加取樣量，并充分研磨粉碎；含有脂類(lèi)較多的動(dòng)物內(nèi)臟器官可先用不含蛋白酶K和SDS的緩沖液浸泡藥材，并試劑盒消化緩沖液中適量增加SDS，以利于脫去脂類(lèi)；分泌物類(lèi)動(dòng)物藥材（如膽汁），在消化前同樣需進(jìn)行必要的處理。如干蛇膽用雙蒸水浸泡6 h，其間更換水?dāng)?shù)次，使其軟化并洗去表面污染物；乙醇浸泡蛇膽，用流水浸泡1 d，以除去乙醇及表面污染物[53]。目前多選用試劑盒法提取DNA，方法相對(duì)簡(jiǎn)潔、易控，而且在大多數(shù)動(dòng)物藥材中都獲得了較為理想的結(jié)果。

2.3 PCR條件及反應(yīng)程序的確定依據(jù)

2.3.1 ITS2序列最佳退火溫度 采用梯度PCR儀對(duì)ITS2序列進(jìn)行擴(kuò)增，溫度梯度設(shè)置為50～61 ℃，篩選得到56 ℃為最佳退火溫度。優(yōu)化的ITS2序列擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2.3.2 psbA-trnH序列最佳退火溫度 psbA-trnH的反應(yīng)程序依照文獻(xiàn)[6，8]。psbA-trnH序列擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

2.3.3 COI序列最佳退火溫度 COI的反應(yīng)程序依照文獻(xiàn)[17-18]。COI序列擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性1 min，45 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。該種方法適合于大多數(shù)動(dòng)物的PCR擴(kuò)增，針對(duì)特殊類(lèi)群，引物及反應(yīng)條件可參見(jiàn)文獻(xiàn)[54-57]。

2.4 確定可靠的DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)

DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的可靠性是中藥材DNA條形碼鑒定的關(guān)鍵。目前已有的公共數(shù)據(jù)庫(kù)，如GenBank，EMBL等，由世界各地的研究者進(jìn)行獨(dú)立提交，缺乏相互之間的驗(yàn)證，數(shù)據(jù)質(zhì)量參差不齊，中藥材DNA序列數(shù)據(jù)的系統(tǒng)性和代表性尚顯不足。

為保證中藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的可靠性，首先需要在基原上保證物種鑒定的可靠性，然后采用嚴(yán)格的序列校對(duì)機(jī)制確保獲得序列和基原樣品的一致性，最后規(guī)范管理數(shù)據(jù)庫(kù)，確保數(shù)據(jù)庫(kù)的安全維護(hù)和有序增減。

2.4.1 獲得可靠的基原樣品 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有代表性，實(shí)驗(yàn)樣品需采集自藥材的原產(chǎn)地和其主要分布區(qū)。通過(guò)調(diào)查和文獻(xiàn)檢索了解藥材的產(chǎn)地和分布信息，每個(gè)產(chǎn)地需采集3份以上的樣品，每種藥材采集的樣品總數(shù)原則上需在20份以上，并且至少覆蓋該藥材80%以上的產(chǎn)地和分布區(qū)。

所有采集的藥材樣品均需先請(qǐng)國(guó)內(nèi)外專(zhuān)科專(zhuān)屬的形態(tài)學(xué)鑒定專(zhuān)家進(jìn)行鑒定以確?；臏?zhǔn)確性，同時(shí)應(yīng)保存好憑證標(biāo)本和憑證照片等信息以備復(fù)查。

采集的藥材樣品及其提取的DNA樣品進(jìn)行規(guī)范化管理，以避免真菌污染和樣品交叉污染。采集的藥材樣品經(jīng)專(zhuān)家鑒定后，根據(jù)樣品編碼規(guī)則對(duì)采集樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)編碼，并進(jìn)行專(zhuān)門(mén)存放。樣品DNA經(jīng)專(zhuān)人按標(biāo)準(zhǔn)流程提取，統(tǒng)一編碼后存放于專(zhuān)門(mén)的-20 ℃冰箱中。對(duì)存放的藥材樣品和藥材DNA樣品需有專(zhuān)人進(jìn)行定期檢查和維護(hù)。

2.4.2 確定序列質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn) Q值，即quality value，是評(píng)價(jià)測(cè)序過(guò)程中堿基可靠性的一個(gè)重要參數(shù)，其計(jì)算公式為Q=-10lgPe（Q指堿基的測(cè)序質(zhì)量值，Pe指堿基的出錯(cuò)概率），一般情況下，單向測(cè)序的堿基質(zhì)量需要大于Q20（99%的可靠性），經(jīng)雙向測(cè)序拼接后的堿基質(zhì)量需要大于Q30（99.9%的可靠性）。

序列質(zhì)量判斷標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)際DNA條形碼協(xié)會(huì)（CBOL）通用的標(biāo)準(zhǔn)[10]，即：以20 bp的窗口分別從序列5′端和3′端進(jìn)行滑動(dòng)，如果窗口內(nèi)有多余2個(gè)堿基的Q小于20，則刪除一個(gè)堿基，窗口繼續(xù)滑動(dòng)一個(gè)堿基，如果窗口內(nèi)堿基Q小于20的數(shù)目小于或等于2個(gè)，窗口停止滑動(dòng)。測(cè)序結(jié)果的剩余部分需大于150 bp，且平均Q大于等于30。

2.4.3 保證序列和基原樣品的一致性 除實(shí)驗(yàn)過(guò)程規(guī)范操作外，采用嚴(yán)格校對(duì)機(jī)制，即BLAST分析防錯(cuò)、系統(tǒng)樹(shù)分析防錯(cuò)、barcoding gap檢驗(yàn)防錯(cuò)，確保實(shí)驗(yàn)獲得的序列和基原樣品的一致性，避免在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于操作不當(dāng)引入的真菌污染和樣品交叉污染。

BLAST分析防錯(cuò)：基于局部序列比對(duì)，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行快速搜索，其特點(diǎn)是僅搜索序列之間高度相似的區(qū)域，可以兼顧搜索的精確性和搜索的速度，是目前應(yīng)用最廣泛的序列相似性搜索工具之一。利用BLAST工具，在一定的E值下（通常是E-20），在GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)或者本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列相似性搜索，確保查詢序列和基原樣品的一致性。

系統(tǒng)樹(shù)分析防錯(cuò)：收集查詢序列同物種序列和同屬其他物種序列，以及2～3條與查詢序列同科但不同屬的物種的序列。利用MEGA5軟件（版本V5.1Beta2），采用K-2P遺傳距離，構(gòu)建這些序列的NJ（neighbor-joining）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，查詢序列應(yīng)與同物種序列聚為一支。

barcoding gap檢驗(yàn)防錯(cuò)：收集與查詢序列同物種和同屬其他物種的序列，分別計(jì)算查詢序列與其他序列的K2P遺傳距離，查詢序列與同物種其他樣品序列的最大遺傳距離應(yīng)該不大于該序列與同屬其他物種樣品之間的遺傳距離。

3 展望

部分中藥材品種混亂給中藥安全使用造成極大隱患，而傳統(tǒng)鑒定方法的局限影響我國(guó)中藥安全有效使用。中藥鑒定技術(shù)方法貫穿于中藥材種植、加工、生產(chǎn)等各個(gè)環(huán)節(jié)，隨著中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，傳統(tǒng)鑒定方法已經(jīng)難以滿足醫(yī)院、藥店、企業(yè)、海關(guān)等各行業(yè)快速、標(biāo)準(zhǔn)的鑒定需求，建立新的鑒定方法十分迫切[58-64]。DNA條形碼分子鑒定技術(shù)為中藥材基原物種的鑒定提供了強(qiáng)有力的科技支撐。構(gòu)建中藥材DNA 條形碼分子鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材基原物種、粉末以及細(xì)胞、組織等材料來(lái)源的準(zhǔn)確快速鑒定，可以滿足不同行業(yè)不同科研背景工作者對(duì)中藥材鑒定的要求。將中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則納入《中國(guó)藥典》，能夠?yàn)橹兴幉腄NA條形碼分子鑒定提供依據(jù)和參考，使其在中藥材流通領(lǐng)域、中藥生產(chǎn)企業(yè)的原料監(jiān)管、醫(yī)院飲片的真?zhèn)舞b定、海關(guān)中藥材進(jìn)出口鑒定與管理、出入境檢驗(yàn)檢疫等方面發(fā)揮強(qiáng)有力的作用。

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Principles for molecular identification of traditional Chinese

materia medica using DNA barcoding

CHEN Shi-lin1， 2*， YAO Hui1， HAN Jian-ping1， XIN Tian-yi1， PANG Xiao-hui1，

SHI Lin-chun1， LUO Kun1， SONG Jing-yuan1， HOU Dian-yun1， SHI Shang-mei3， QIAN Zhong-zhi3

（1. The National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials， Institute of Medicinal

Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100193， China；

2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

3. Chinese Pharmacopoeia Commission， Beijing 100061， China）

[Abstract] Since the research of molecular identification of Chinese Materia Medica （CMM） using DNA barcode is rapidly developing and popularizing， the principle of this method is approved to be listed in the Supplement of the Pharmacopoeia of the People's Republic of China. Based on the study on comprehensive samples， the DNA barcoding systems have been established to identify CMM， i.e. ITS2 as a core barcode and psbA-trnH as a complementary locus for identification of planta medica， and COI as a core barcode and ITS2 as a complementary locus for identification of animal medica. This article introduced the principle of molecular identification of CMM using DNA barcoding and its drafting instructions. Furthermore， its application perspective was discussed.

[Key words] Chinese pharmacopoeia； traditional Chinese materia medica； DNA barcoding； molecular identification； principle

doi：10.4268/cjcmm20130201

[責(zé)任編輯 曹陽(yáng)陽(yáng)]