不同手術(shù)時間對骨折愈合過程中VEGF表達(dá)的影響

董黎強 尹航 王維佳 王昌興 胡偉鋒

不同手術(shù)時間對骨折愈合過程中VEGF表達(dá)的影響

董黎強 尹航 王維佳 王昌興 胡偉鋒

目的觀察不同手術(shù)時間對實驗大鼠骨折愈合過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）表達(dá)的影響。方法對192只大鼠股骨進行閉合骨折造模，在造模后第1、3、5、7、11、14天分別對骨折采取切開復(fù)位內(nèi)固定手術(shù)，并在骨折后第1、3、5、7、11、14、21、35、49天對大鼠骨折端進行VEGF免疫組化染色觀察，對其表達(dá)結(jié)果進行統(tǒng)計分析。結(jié)果手術(shù)操作干預(yù)了實驗大鼠骨折愈合不同階段VEGF的表達(dá)強度及表達(dá)時間。第7、11天手術(shù)組能較好地促進骨折端VEGF表達(dá)，且能持續(xù)更長時間，第14天手術(shù)組次之。第5天手術(shù)組僅在表達(dá)強度上高于未手術(shù)組，當(dāng)天手術(shù)組與未手術(shù)組則無明顯差別。而第3天手術(shù)組在骨折愈合的各階段均處于較低水平，且低于未手術(shù)組。結(jié)論手術(shù)操作時機能影響實驗大鼠骨折端VEGF的表達(dá)，可能導(dǎo)致二次損傷加速現(xiàn)象，但最佳手術(shù)時機在第1～2周時段，骨折后幾天內(nèi)即進行手術(shù)操作可能不利于骨折的愈合。

骨折愈合 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 手術(shù)時間

【 Abstract】 ObjectiveTo observe the effect of time interval of operation on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)in bone during fracture healing in rats．MethodsClosed femoral fracture was induced in 192 Wistar rats．The fracture was treated with open reduction and internal fixation operation at 1,3,5,7,11 and 14d after fracture．The expression of VEGF in fracture end at different time points(d1,3,5,7,11,14,21,35 and 49)were detected with immunohistochemical staining．ResultsThe expression of VEGF was strongest and last longer in rats operated at d7 or d11 after fracture,followed by those operated at d14．The expression intensity was higher in rats operated d5 after fracture than those without operation．There was no difference in VEGF expression between rats operated at d1 and non-operated rats;while rats operated at d3 presented low VEGF expression at all time points of fracture healing，which even lower than that in rats without operation．ConclusionThe results suggest that the optimal timing of surgery may be within the 1～2 weeks after fracture．

目前，隨著接骨學(xué)的發(fā)展，骨折的治療與手術(shù)切開復(fù)位內(nèi)固定之間存在著密不可分的關(guān)系。調(diào)查表明，手術(shù)治療的患者發(fā)生骨不連的概率比保守治療的患者高出4倍[1]。通常人們會籠統(tǒng)的認(rèn)為手術(shù)切開會過多地剝離骨膜損傷局部血供，對于骨折愈合是一個不利因素，但很少有人從手術(shù)的時機上加以考慮。我們在臨床工作中發(fā)現(xiàn)一些過早手術(shù)的患者骨折端出現(xiàn)了骨愈合不良或骨不連接，而適當(dāng)延遲手術(shù)的患者反而愈合得更好。由此我們認(rèn)為手術(shù)治療的效果不僅僅與局部的血運有關(guān)，而且還與手術(shù)時機有著密切的關(guān)聯(lián)。因此，我們進行了本項實驗，期望對骨折二次損傷加速現(xiàn)象的分子生物學(xué)基礎(chǔ)作一初步的研究，并對骨折最佳手術(shù)時間作進一步探索。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選用Wistar大鼠192只，體重220g左右，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。飼養(yǎng)條件一致，室溫（24±2）℃，標(biāo)準(zhǔn)飼料（由南京安立默科技有限公司生產(chǎn)），自由攝食、飲水。全部動物經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周以上無異常后開始正式實驗。

1.2 主要實驗儀器 改良的Einhorn造模支架；LEICA RM2035型切片機；全自動脫水機；Olympus BX50熒光顯微鏡；IPP計算機真彩圖像分析系統(tǒng)；即用型SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品）。

1.3 方法

1.3.1 制作閉合骨折模型 將192只大鼠用10%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)按40mg/kg注射，麻醉后取右下肢髕骨內(nèi)側(cè)切口縱行切開,將髕骨牽向外側(cè)使之脫位，暴露股骨髁間凹。逆行插入克氏針（直徑1mm），從大轉(zhuǎn)子及皮膚穿出，克氏針遠(yuǎn)端埋于股骨髁間骨皮質(zhì)下，近端緊貼大轉(zhuǎn)子將尾部折彎，多余部分剪除后逐層閉合切口。將動物右下肢外展內(nèi)旋位固定于閉合骨折模型打擊器的鐵砧凹槽上(鐵砧凹槽間距為15mm)，造模支架中柱下端的骨刀壓于大腿中部,助手提起500g的砝碼至20cm處，讓其自由落體撞擊中央鋼板[2]，致股骨中段骨折。術(shù)后立即在麻醉狀態(tài)下拔出克氏針，用拇指和示指按摸骨折端，了解骨折類型，要求骨折類型為股骨中段橫行及短斜形骨折。造模不合格的大鼠予以剔除，并及時補充。1.3.2 動物分組及閉合骨折開放復(fù)位內(nèi)固定操作 將符合條件的192只已制作閉合骨折模型的大鼠采用完全隨機法分為以下7組：未手術(shù)組A，36只；骨折后第1天（當(dāng)天）手術(shù)組B，36只；骨折后第3天手術(shù)組C，32只；骨折后第5天手術(shù)組D，28只；骨折后第7天手術(shù)組E，24只；骨折后第11天手術(shù)組F，20只；骨折后第14天手術(shù)組G，16只。

1.3.3 各組不同處理 造模后A組在骨折后8h、第3、5、7、11、14、21、35、49天各時間點以斷頸法處死4只大鼠并觀察。

B組在骨折后即行骨折端切開復(fù)位內(nèi)固定術(shù)。具體操作如下：用10%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)按40mg/kg注射麻醉，起效后俯臥位，備右后肢皮膚。常規(guī)消毒鋪巾，行右股骨后外側(cè)切口，分離皮下組織和右后側(cè)肌間隙，顯露股骨中段骨折端，保護骨膜，骨折端復(fù)位。切開膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊，暴露股骨內(nèi)外側(cè)髁，于髁間倒置入直徑l.5mm的克氏針，固定骨折斷端?？p合切口，紗布包扎。術(shù)后3d青霉素注射防止感染。在術(shù)后8h、第3、5、7、11、14、21、35、49天各時間點以斷頸法處死4只大鼠并觀察。

C組在骨折后第3天行骨折端切開復(fù)位內(nèi)固定術(shù)。具體操作同B組。在術(shù)后8h、第3、5、9、12、19、33、47天（即骨折后第3、5、7、11、14、21、35、49天）各時間點以斷頸法處死4只大鼠并觀察。

D組在骨折后第5天行骨折端切開復(fù)位內(nèi)固定術(shù)。具體操作同B組。在術(shù)后8h、第3、7、10、17、31、45天（即骨折后第5、7、11、14、21、35、49天）各時間點以斷頸法處死4只大鼠并觀察。

E組在骨折后第7天行骨折端切開復(fù)位內(nèi)固定術(shù)。具體操作同B組。在術(shù)后8h、第5、8、15、29、43天（即骨折后第7、11、14、21、35、49天）各時間點以斷頸法處死4只大鼠并觀察。

F組在骨折后第11天行骨折端切開復(fù)位內(nèi)固定術(shù)。具體操作同B組。在術(shù)后8h、第4、11、25、39天（即骨折后第11、14、21、35、49天）各時間點以斷頸法處死4只大鼠并觀察。

G組在骨折后第14天行骨折端切開復(fù)位內(nèi)固定術(shù)。具體操作同B組。在術(shù)后8h、第8、22、36天（即骨折后第14、21、35、49天）各時間點以斷頸法處死4只大鼠并觀察。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 取材 各組大鼠處死后，以骨折端為中心，取下長度為1cm完整保留外骨膜以及骨痂的骨組織。

1.4.2 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）免疫組化染色觀察 立即將骨組織經(jīng)10%的中性福爾馬林液固定,蒸餾水沖洗后，置入5%乙二胺四乙酸（EDTA）液中脫鈣10～15d。脫鈣成功后取材，沖水24h，脫水，石蠟包埋，5μm厚連續(xù)切片。切片進行VEGF免疫組化染色，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）方法顯色，陽性為棕色。用計算機彩色圖像分析系統(tǒng)測定骨痂中VEGF含量。顯微鏡下放大400倍，每個標(biāo)本隨機取5個視野，作陽性表達(dá)計數(shù)，以5個視野計數(shù)均值作為各標(biāo)本VEGF表達(dá)的計量指標(biāo)，結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠VEGF表達(dá)的數(shù)值曲線 見圖1。

圖1 各組大鼠骨折端VEGF陽性染色細(xì)胞數(shù)量變化曲線圖

由圖1可見，A、B、C、D組VEGF表達(dá)的數(shù)值曲線在骨折后第14天達(dá)峰值，之后逐漸下降，E、F、G各組VEGF表達(dá)的數(shù)值曲線在骨折后第14、21天時進一步上揚，在第21天時達(dá)峰值，之后逐漸下降。在第35天時各組仍有一定的VEGF表達(dá)，E、F、G組較為明顯。2.2 各組大鼠骨折端VEGF陽性免疫組化染色細(xì)胞計數(shù)比較 見表1。

表1 各組大鼠骨折端免疫組化VEGF陽性染色細(xì)胞計數(shù)比較

由表1可見，在第14天時，D、E、F組VEGF表達(dá)＞A、B、G組＞C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01））；在第21天時，E、F、G組VEGF表達(dá)＞D＞A、B、C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01）；在第35天時，E組VEGF表達(dá)＞F、G＞A、B、C、D組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01）；第49天時，隨著骨折漸趨愈合，各組僅有少量VEGF表達(dá)，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

骨折修復(fù)是一個極其復(fù)雜的過程。血管形成，恢復(fù)骨折端供血是骨折修復(fù)的前提。VEGF是功能最強大的血管生成調(diào)節(jié)因子，通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和血管生成[3]。血管生成對骨折段供氧、提供營養(yǎng)物質(zhì)、運輸代謝廢物起到舉足輕重的作用，為局部骨再生及代謝提供了有利的微環(huán)境。Spector等[4]發(fā)現(xiàn)VEGF對體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞無增殖的作用，但能引發(fā)成骨細(xì)胞的遷移及分化，且引起成骨細(xì)胞遷移及分化所需的濃度比BMP-2還低100倍。另有研究表明在軟骨內(nèi)化骨，特別是在骨形成偶合軟骨吸收的過程中，VEGF對原始成骨細(xì)胞有趨化遷移作用，對骨的形成和重建有功能性的作用[5]。Connoly[6]指出：骨折愈合完全依靠血管再形成過程，評價骨折愈合過程完全依靠血管再形成過程。因此，我們選用VEGF指標(biāo)進行檢測，對于了解不同手術(shù)時間對骨折愈合過程的影響具有重要意義。

本實驗結(jié)果提示表明，E、F、G組的VEGF表達(dá)明顯強于A、B、C、D各組，且持續(xù)時間更長，其中E＞F＞G組，D組雖差于E、F、G組，但略優(yōu)于A、B組，C組表現(xiàn)則最差。因此，各組骨折愈合過程中VEGF表達(dá)程度粗略排名顯示為：E＞F＞G＞D＞B=A＞C組。由此我們可以得出結(jié)論：手術(shù)操作干預(yù)了實驗大鼠骨折愈合不同階段VEGF的表達(dá)強度及表達(dá)時間。但并不是在任何時間點采取手術(shù)操作均是有益的，我們認(rèn)為第7天手術(shù)組最能促進骨折端VEGF表達(dá)，且能持續(xù)更長時間。第11天手術(shù)組也能較好地促進骨折端VEGF表達(dá)，并能持續(xù)較長時間，第14天手術(shù)組次之。而第5天手術(shù)組僅在表達(dá)強度上高于自然愈合的未手術(shù)組，當(dāng)天手術(shù)組與未手術(shù)組則無明顯差別，未表現(xiàn)出明顯促進骨折端VEGF表達(dá)的作用。而第3天手術(shù)組在骨折愈合的各階段均處于較低水平，且低于未手術(shù)組。

研究表明，骨折后1周內(nèi)，骨折局部因創(chuàng)傷導(dǎo)致血流中斷，VEGF表達(dá)量較弱，隨著骨折的修復(fù)，肉芽組織的增長加快，血供相對減少，氧分壓降低，低氧狀態(tài)強烈誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)。大約在骨折后2～3周，VEGFm-RNA表達(dá)量達(dá)到高峰，而此時恰為軟骨細(xì)胞合成期。VEGF在軟骨內(nèi)成骨過程中協(xié)調(diào)著軟骨細(xì)胞向骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[7-9]。我們推測在術(shù)后幾天內(nèi)即對骨折端進行手術(shù)操作可能加重創(chuàng)傷，破壞骨膜的血管，導(dǎo)致血流中斷加劇，從而進一步減少VEGF的表達(dá)。在1～2周時段，骨折端肉芽生長明顯，骨膜增厚，盡管手術(shù)操作時適當(dāng)?shù)厍虚_了骨膜，但對骨折端血流破壞較少，而且延長了炎癥期，促進了局部毛細(xì)血管的生成，使局部的血運得以進一步加強，從而有利于骨折的愈合，而這一切的發(fā)生與VEGF的分泌是緊密相關(guān)的。

綜上所述，我們認(rèn)為骨折后采取手術(shù)操作能影響實驗大鼠骨折端VEGF的表達(dá)，可能導(dǎo)致二次損傷加速現(xiàn)象，但最佳手術(shù)時機在1～2周時段，骨折后幾天內(nèi)即進行手術(shù)操作可能不利于骨折的愈合。

[1] Joseph A B,Thomas A E,Sheldon R S,主編．骨科基礎(chǔ)科學(xué)[M]．2版,北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:321-360．

[2] 周曉中,董啟榕,張?。笫蠊晒情]合骨折模型的制作[J]．東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2007,26(1):60-62．

[3] Millauer B,Wizigmann Voos S,Schnurch H,et al．High affinityVEGF binding and developmental expression suggest Flk21 as a major regulator of vasculogenesis and angiogenesis[J]．Cell, 1993,72:835．

[4] Spector J A,Mehrara B J,Greenwald J A,et al．Osteoblast expression of vascular endothelial growth factor is modulated by the extra cellular microenvironment[J]．Am J Physiol Cell Physiol, 2001,280(1):C72．

[5] Mayr2Wohlfart U,Waltenberger J,Hausser H,et al．Vascular endothelial growth factor stimulates chemotactic migration of primary human osteoblasts[J]．Bone,2002,30(3):472．

[6] Connolly J F．Injectable bone marrow preparations to stimulate osteo-genic repair[J]．Clin Orthop Relat Res,1995,313(4):8-18．

[7] Kaspar D,Neidlinger-Wilke C,Holbein O,et al．Mitogens are increased in the systemic circulation during bone callus healing [J]．J Orthop Res,2003,21:320-325．

[8] Park S H,O'Connor K M,McKellop H A．Interaction between active motion and exogenous transforming growth factor Beta during tibial fracture repair[J]．J Orthop Trauma,2003,17:2-10．

[9] Szczesny G．Molecular aspects of bone healing and remodeling [J]．Pol J Pathol,2002,53:145-153．

Time interval of operation on VEGF expression in bone during fracture healing

Fracture healing Vascular endothelial growth factor Operative time

2012-10-23）

（本文編輯：田云鵬）

浙江省教育廳科研項目（20050869）

工作單位：310005 杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨一科（董黎強、尹航、王昌興、胡偉鋒）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)骨傷教研室（王維佳）

董黎強，E-mail：dlq58@126.com