細胞凋亡在牙齒發(fā)育中的研究進展

許 姍 陳貴妙 林陳勝 福建師范大學生命科學學院 福州 350108

細胞凋亡（apoptosis），是多細胞生物體調(diào)控機體發(fā)育，維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞主動死亡過程。細胞凋亡一詞提出至今已有40多年。隨著細胞生物學、遺傳學、分子生物學等相關學科的發(fā)展，對其分子機制的認識有了更深入的了解，細胞凋亡已逐漸成為生命科學的研究熱點。

長期以來，細胞凋亡往往又被稱為程序性細胞死亡（programmed ce11death，PCD），兩種名稱經(jīng)常被混淆使用，而事實上，兩者的涵義是不同的。PCD是機制上的概念，用于描述發(fā)生于各生物種系胚胎發(fā)育過程中的正常細胞死亡的所有表型，具高度可遺傳的時序性和空間性，即細胞在發(fā)育的特定階段按序死亡。而細胞凋亡是形態(tài)學的概念，是對多種方式引起的一種特征性形態(tài)和生化改變的概括。它并非代表引起細胞死亡的過程和路徑而是指眾多因素造成的眾多死亡途徑的最終表現(xiàn)。

早在19世紀，發(fā)育生物學家就發(fā)現(xiàn)無論是胚胎發(fā)育過程中，還是胚后發(fā)育，均存在細胞的死亡現(xiàn)象。細胞凋亡機制已經(jīng)包含在許多精細的組織器官胚胎發(fā)育中，如腎臟、心臟、神經(jīng)系統(tǒng)、上皮組織等，它通過控制細胞數(shù)目和組織形狀，在器官形態(tài)發(fā)生和形成時起重要作用［1］。

1 牙齒發(fā)育中的細胞凋亡

哺乳動物牙齒發(fā)育是由外胚層來源的上皮細胞和顱神經(jīng)嵴來源的間充質細胞共同分化而來的，其中牙釉質由上皮細胞分化形成，牙本質、牙髓等其他結構是由間充質細胞分化形成。在組織形態(tài)學上，人類的牙齒發(fā)生與小鼠的磨牙發(fā)生極為相似［2］。在小鼠中，牙齒發(fā)生的定位是在胚胎發(fā)育的E10.5（胚胎齡第10.5 d）［2］。哺乳動物的牙齒發(fā)育均會經(jīng)歷一系列上皮增厚的過程：牙板期、牙蕾期、帽狀期和鐘狀期，同時伴隨著牙釉質的分泌礦化［3］。牙齒的形態(tài)發(fā)生是在特定時空所發(fā)生的由諸多相關基因嚴格調(diào)控的一系列生理過程，包括細胞增殖、細胞凋亡的抑制或刺激、細胞周期調(diào)節(jié)等［4］。

牙齒作為研究哺乳動物器官發(fā)育的一個模型，其細胞凋亡已有大量研究。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠牙胚發(fā)育中存在著細胞凋亡現(xiàn)象，提示細胞凋亡在牙齒發(fā)育中有重要作用［5］。同時，應用TUNEL技術研究小鼠牙胚發(fā)育過程中的細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡參與了牙上皮與牙間充質的相互作用，調(diào)控牙尖、牙頸及牙根的形成，發(fā)揮塑形作用［6］。

細胞凋亡最早發(fā)生在蕾狀期，表明細胞凋亡參與了牙蕾結構的形成［7］。帽狀期，細胞凋亡位于原發(fā)性釉結節(jié)（Primary ename1knot）中。隨著牙胚發(fā)育進入鐘狀期，細胞凋亡又在繼發(fā)性釉結節(jié)（Secondary ename1knot）中出現(xiàn)。這一結果表明，釉結節(jié)在完成其誘導牙尖形成的功能后，通過細胞凋亡機制而被清除。用體外重組實驗研究，證實細胞凋亡在牙胚發(fā)育中的作用。將E13小鼠牙胚的上皮與間充質分離后分別進行體外培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)在上皮和間充質中均有凋亡細胞。當兩者共培養(yǎng)時，在兩個組織接觸的區(qū)域細胞凋亡受到明顯抑制。這個結果表明上皮與間充質的相互作用可以抑制細胞凋亡。將成纖維細胞生長因子-4（FGF-4）加入培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)其能明顯抑制間充質的細胞凋亡。因此，信號因子的作用會影響上皮與間充質的相互作用，最終可能導致細胞凋亡［5］。

小鼠磨牙牙胚中，原發(fā)性釉結節(jié)參與了牙齒從蕾狀期向帽狀期的轉變過程［8］。牙胚發(fā)育至帽狀期，凋亡細胞主要集中在內(nèi)釉上皮凹面中心區(qū)域（即原發(fā)性釉結節(jié)）。隨著牙胚發(fā)育至鐘狀期，研究證實繼發(fā)性釉結節(jié)決定著未來牙尖的位置，調(diào)節(jié)牙胚形狀，尤其是牙尖形成的信號調(diào)控中心［9］。原發(fā)性釉結節(jié)與繼發(fā)性釉結節(jié)均表達了一系列的信號分子，如Fgf-4，參與了細胞凋亡［9］。隨后，有研究發(fā)現(xiàn)存在著第三種釉結節(jié)，出現(xiàn)在靠近牙尖無釉質分泌的區(qū)域，研究認為其對于調(diào)控釉質的沉積有重要的作用［10］。Mata1ova等利用激光捕獲顯微切割技術，將原發(fā)性釉結節(jié)分離培養(yǎng)細胞，研究結果表明，此類細胞是研究牙齒發(fā)育中細胞凋亡的分子機制的一類重要的細胞［11］。已有超過50種基因被證實在釉結節(jié)中有顯著表達，如 Shh、Bmp-2、Bmp-4、Bmp-7、Fgf-4 等［12］。釉結節(jié)在完成其誘導牙齒發(fā)育及其信號調(diào)控作用后，通過細胞凋亡機制而被清除。

2 牙齒發(fā)育中細胞凋亡相關因子

發(fā)育中的細胞凋亡，是在許多基因調(diào)控下發(fā)生的生理性現(xiàn)象，其中Caspases和Bc1-2基因家族等是重要的細胞凋亡相關因子。

2.1 Caspases Caspases（cysteiny 1 aspartate-specific proteases），是一組存在于胞質溶膠中的結構上相關的半胱氨酸蛋白酶，能夠特異地切割天冬氨酸殘基后的肽鍵，是一類與凋亡密切相關的蛋白水解酶家族，該家族成員按其發(fā)現(xiàn)先后分別被命名為Caspase 1-14。Caspases-3是Caspases家族中最主要的凋亡執(zhí)行者之一，可促進凋亡，并被Bc1-2阻止。在牙胚中Caspases-3陽性細胞與Tune1陽性凋亡細胞分布一致，表明在牙齒發(fā)育期細胞凋亡可能是由于激活了 Caspases家族［13-14］。

利用 Caspases-3突變鼠（knock-out）研究 Caspases-3在牙齒發(fā)育中的功能［15］，發(fā)現(xiàn)在突變鼠的原發(fā)性釉結節(jié)中檢測到細胞凋亡的存在，第一磨牙有暫時性的改變。然而，這些形態(tài)學的變化在隨后的發(fā)育過程中都得以補償，最終形成正常的牙齒形態(tài)。因此，Caspases-3雖然參與了牙齒的細胞凋亡，但是似乎不是牙齒形成所必須的。在牙齒發(fā)育早期，特別是在原發(fā)性釉結節(jié)中，Caspases-3的缺乏并不會影響最終恒牙的結構、形態(tài)和組織分化。

在Caspases-9和Apaf-1突變鼠中，在原發(fā)性釉結節(jié)中并未發(fā)現(xiàn)有細胞凋亡［16］。與Caspases-3突變鼠不同的是，Caspases-9和Apaf-1突變鼠在鐘狀期并未發(fā)生形態(tài)學上的變化。雖然在原發(fā)性釉結節(jié)中沒有檢測到細胞凋亡，但是從帽狀期到鐘狀期的轉變與野生型小鼠的表型一致。因此，認為這種放大機制，特別是通過凋亡受體作用，是線粒體與Caspases之間連接進行協(xié)同作用，從而啟動細胞凋亡［17］。

有研究報道利用磨牙離體培養(yǎng)檢測Caspases（半胱天冬酶）的抑制作用［18］。在E13.5小鼠磨牙的離體培養(yǎng)中，通過藥物抑制Caspases的活性，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)上并未有明顯變化。由于Caspases被抑制細胞沒有發(fā)生凋亡，釉結節(jié)依然存在并未消失。同時，在存留的釉結節(jié)中，Shh、Msx-2、Bmp-2、Bmp-4 等基因的表達下調(diào)，表明釉結節(jié)中信號的缺失能夠引起其本身不被消除。因此，細胞凋亡的缺失，不會影響牙齒形態(tài)的形成。細胞凋亡的作用可能僅僅只是清除停止生長的細胞，而不是抑制釉結節(jié)發(fā)揮其信號調(diào)節(jié)作用。然而，運用Caspases抑制劑干擾早期牙齒發(fā)育，卻發(fā)現(xiàn)牙齒的形態(tài)最終被改變，因此，釉結節(jié)中發(fā)生的細胞凋亡對于牙齒正常的形態(tài)和大小也是必要的［19］。關于釉結節(jié)中所發(fā)生的細胞凋亡的準確作用，仍然需要進一步的研究證實。

2.2 Bc1-2/Bax Bc1-2是從濾泡性淋巴瘤中分離出的一種原癌基因［20］。已知Bc1-2通過控制核內(nèi)外物質的運輸、抑制Ca2+的釋放或阻斷細胞內(nèi)外過氧化物的堆積而抑制細胞的凋亡。而Bax基因是第一個分離到的Bc1-2同源基因，可與Bc1-2形成異源二聚體（Bc1-2/Bax）從而拮抗Bc1-2抑制細胞凋亡的作用，是一種凋亡相關基因。Bc1-2與Bax所形成的異源二聚體中兩者的比例決定細胞到底該向存活還是死亡的方向發(fā)展［21］。

Bc1-2在牙齒發(fā)育的早期表達較強，在牙體組織形成后表達下調(diào)［22］。在成釉細胞中也檢測到Bc1-2的表達［23］。表明Bc1-2基因在牙齒形態(tài)形成過程中，是調(diào)控細胞增殖、分化、成熟、消亡的重要因素。

有研究發(fā)現(xiàn)，大部分牙胚細胞均同時表達Bc1-2和Bax［24］。Bax在外釉上皮中表達更強，而在內(nèi)釉上皮中Bc1-2表達更強。星網(wǎng)層中，有一些細胞僅單一表達Bc1-2或者Bax，也有一些兩者同時表達。間充質中大部分只表達Bax。利用轉基因小鼠在成牙本質細胞中過表達Bc1-2，研究發(fā)現(xiàn)過表達Bc1-2會導致牙齒發(fā)育過程的異常，成牙本質細胞凋亡受抑制［25］。然而，雖然成牙本質細胞的增殖率或死亡率均受到了影響，但突變鼠與野生鼠中成牙本質細胞的密度并未發(fā)現(xiàn)明顯變化。成牙本質細胞密度未改變，可能是由于牙髓腔體積的均衡變化（突變鼠的牙髓腔比野生型的大），也可能是由于其他未知的原因，仍需要更深入的研究。

3 結語

細胞凋亡存在于牙齒發(fā)育的各個階段，也已被證實在細胞的增殖和消亡方面有重要的作用，控制著整個牙齒的發(fā)育進程。釉結節(jié)作為信號中心，其細胞凋亡也對牙齒的形成有重要影響。牙齒發(fā)育過程中受到多種自身基因的調(diào)控，細胞凋亡的啟動和進行源于這些基因的相互作用。實驗已初步揭示這些凋亡基因在牙齒發(fā)育中的重要影響，但細胞凋亡在發(fā)育中的準確作用尚未明確表明。因此，對牙齒發(fā)育中細胞凋亡信號分子的深入研究，不僅對于我們認識其發(fā)生機制有益，更重要的是對臨床診斷及其相關疾病預防和治療有重大的幫助。

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