槐定堿結(jié)構(gòu)改造及其抗腫瘤活性*

高 鵬，鐘 俊，王國(guó)成

(1. 天津市藥品審評(píng)中心，天津 300191， 2.天津天士力集團(tuán)研究院化學(xué)藥物研究所，天津 300410)

槐定堿(sophoridine)是從我國(guó)西北中藥苦豆子(SophoraalopecuroidesL)中分離出的一類苦參生物堿，化學(xué)結(jié)構(gòu)與苦參堿相似，都屬于四環(huán)的喹諾里西啶生物堿[1]?；倍▔A具有廣泛的藥理學(xué)作用，如抗腫瘤、抗心律失常、抗炎、抗病毒等[2]。2005年8月槐定堿及其制劑鹽酸槐定堿注射液(sophoridine hydrochloride injection)作為我國(guó)自主研制的一類抗癌新藥，經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市[3]。臨床上，槐定堿對(duì)惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤有顯著療效，對(duì)惡性淋巴瘤和消化道腫瘤也有一定療效，具有安全性好、毒副反應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)?；倍▔A結(jié)構(gòu)與現(xiàn)有抗癌化療藥結(jié)構(gòu)都不相同，是新型結(jié)構(gòu)的抗癌新藥，對(duì)槐定堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造并進(jìn)一步研究其構(gòu)效關(guān)系的報(bào)道很少[4,5]，而且不破壞槐定堿骨架對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的研究未見報(bào)道。因此本試驗(yàn)以槐定堿為先導(dǎo)化合物，對(duì)槐定堿骨架的14位碳進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成了8個(gè)槐定堿衍生物，并進(jìn)行體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)。衍生物①、②和③的合成參考文獻(xiàn)方法改進(jìn)[6]，并進(jìn)一步對(duì)②和③的立體構(gòu)型進(jìn)行了鑒定，隨后通過(guò)控制反應(yīng)條件來(lái)控制產(chǎn)物的立體構(gòu)型，合成路線見圖1。

1 儀器和試劑

Bruke AV400 超導(dǎo)核磁共振儀；Agilent G6300離子肼質(zhì)譜；SHZ-III型循環(huán)水真空泵；DF-101s恒溫集熱磁力攪拌器；Laborota 4001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Vacuubrand MD4C隔膜真空泵；YRT-3熔點(diǎn)儀，溫度未經(jīng)校正?；倍▔A(>98%，江蘇南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；所用試劑均為市售的分析純或化學(xué)純?cè)噭訉游龊椭鶎游龇謩e采用GF254和200～300目硅膠(青島海洋化工廠)。

圖1 槐定堿衍生物的合成

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.114-二氯槐定堿(化合物①)的制備 將槐定堿 5 g (0.02 mol)和二氯亞砜 100 ml (1.40 mol) 置于500 ml 圓底燒瓶中，油浴中攪拌加熱80 ℃反應(yīng)12 h，自然冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入1 L冰水中，不斷攪拌，用6N的氫氧化鈉溶液中和至pH=7，用500 ml × 3 CH2Cl2萃取，無(wú)水Na2SO4干燥，減壓濃縮，經(jīng)硅膠柱層析分離，乙酸乙酯-石油醚(4∶1)洗脫，可得亮黃色固體4.5 g，收率70%。mp 125 ～ 127 ℃，1H NMR (400 MHz， CDCl3): δ 3.54-3.47 (m, 2H), 3.28-3.21 (dd, 1H), 2.89-2.86 (m, 1H), 2.85-2.75 (m, 2H), 2.66-2.59 (m, 1H), 2.27-2.17 (m, 2H), 2.15-2.08 (m, 1H), 2.01-1.79 (m, 6H), 1.74-1.59 (m, 2H), 1.58-1.45 (m, 3H), 1.13-1.02 (m, 1H)。MS: m/z 339 [M+Na]+。

2.214 α-氯槐定堿(化合物②)和14β-氯槐定堿(化合物③)的制備 將化合物① 5 g (16 mmol) 溶于100 ml 無(wú)水乙醇中，加入200 mg 10% 鈀碳，在氫氣壓力為5.0 MPa壓力下，加熱80 ℃反應(yīng)24 h，自然冷卻至室溫，過(guò)濾除去鈀碳，減壓濃縮濾液，經(jīng)硅膠柱層析分離，乙酸乙酯-石油醚(3∶1)洗脫，可分別得到亮黃色固體(化合物②和化合物③)分別為2.0 g和1.6 g，總收率81%。化合物② mp 133～135 ℃，1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.40-4.37 (q, 1 H,J= 5 Hz, 10 Hz, 14-H), 3.41-3.36 (m, 1 H), 2.86-2.83 (m, 1 H), 2.77-2.70 (m, 1 H), 2.35-2.26 (m, 2H), 2.24-2.16 (m, 2 H), 2.04-1.98 (m, 2H), 1.96-1.83 (m, 3H), 1.81-1.75 (m, 1H), 1.72-1.60 (m, 1H), 1.58-1.45 (m, 4H), 1.43-1.37 (m, 1H), 1.10-1.00 (m, 1H)。MS: m/z 305 [M+Na]+；化合物③ mp 85 ～ 88 ℃，1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.34 (dt, 1H,J=4 Hz, 14-H), 3.39-3.43 (dd, 1H,J=5 Hz, 14 Hz), 3.32-3.37 (m, 1H,J= 5 Hz), 3.02-3.08 (m, 1H), 2.76-2.79 (m, 1H), 2.65-2.71 (m, 1H), 2.03-2.10 (m, 3H), 1.94-2.01 (m, 2H), 1.81-1.92 (m, 3H), 1.71-1.79 (m, 3H), 1.51-1.62 (m, 2H), 1.38-1.49 (m, 3H), 0.90-1.00 (m, 1H)。MS: m/z 305 [M+Na]+。

2.314 β-乙酰氧基槐定堿(化合物④)14α-乙酰氧基槐定堿(化合物⑤)的制備 將化合物② 5 g (18 mmol)、50 ml 二甲基甲酰胺和醋酸銫 5 g (26 mmol)置于100 ml 圓底燒瓶中，加熱120 ℃反應(yīng)12 h，自然冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入200 ml水中，用100 ml × 3 CH2Cl2萃取，無(wú)水Na2SO4干燥，減壓濃縮濾液，經(jīng)硅膠柱層析分離，乙酸乙酯-石油醚(5∶1)洗脫，可得到無(wú)色油狀物 1.4 g，收率64%。同法制備14α-乙酰氧基槐定堿(化合物⑤)。化合物④ mp 84 ～ 86 ℃，MS:1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.24-5.21 (m, 1H, 14-H), 3.48-3.42 (m, 1H), 3.37-3.31 (m, 2H), 2.90-2.86 (m, 1H), 2.81-2.75 (m, 1H), 2.29-2.22 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 2.11-2.09 (m, 1H), 2.03 (m, 7H), 1.78-1.64 (m, 2H), 1.59-1.41 (m, 4H), 1.16-1.05 (m, 1H)。m/z 329 [M+Na]+；化合物⑤ mp 141～143℃，1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.58-3.53 (dd,J=6 Hz, 11Hz, 1H, 14-H), 3.47-3.41 (m, 1H), 3.14-3.07 (m, 1H), 2.89-2.86 (m, 1H), 2.81-2.75 (m, 1H), 2.28-2.24 (m, 1H), 2.20-2.13 (m, 5H), 2.11-2.04 (m, 1H), 2.01-1.89 (m, 3H), 1.87-1.80 (m, 2H), 1.77-1.70 (m, 1H), 1.67-1.65 (m, 4H), 1.53-1.47 (m, 3H), 1.09-1.00 (m, 1H)。MS: m/z 329 [M+Na]+。

2.414β-羥基槐定堿(化合物⑥)14α-羥基槐定堿(化合物⑦)的制備 將化合物④ 200 mg (0.7 mmol)溶于5 ml 甲醇中，加入5 mg (0.09 mmol)甲醇鈉，于室溫反應(yīng)12 h，減壓濃縮，經(jīng)硅膠柱層析分離，乙酸乙酯-石油醚(8∶1)洗脫，可得到白色固體 130 mg，收率76%。同法制備14 α-羥基槐定堿(化合物⑦)?；衔铫?mp 101 ～ 103 ℃，1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.99-3.95 (dd, 1H,J= 6 Hz, 11 Hz, 14-H), 3.63-3.57 (dd, 1H,J= 11 Hz, 14 Hz), 3.31-3.22 (m, 2H), 2.91-2.88 (m, 1H), 2.81-2.75 (m, 1H), 2.40-2.31 (m, 2H), 2.22-2.17 (dd, 1H), 2.13-2.07 (m, 1H), 2.01-1.80 (m, 7H), 1.78-1.66 (m, 2H), 1.61-1.50 (m, 3H), 1.45-1.37 (m, 1H), 1.19-1.12 (m, 1H)。MS: m/z 287 [M+Na]+；化合物⑦ mp 114 ～116℃，1H NMR(400 MHz, CDCl3): δ 3.98-3.94 (dd, 1H,J= 5 Hz, 12 Hz, 14-H)，3.60-3.56 (dd, 1H,J= 4 Hz, 14 Hz), 3.46-3.40 (dt, 1H,J= 5 Hz, 10 Hz), 3.09-3.03 (m, 1H), 2.88-2.85 (m, 1H), 2.81-2.75 (m, 1H), 2.29-2.21 (m, 2H), 2.20-2.13 (m, 1H), 2.10-2.03 (m, 1H), 2.02-1.89 (m, 3H), 1.86-1.82 (m, 1H), 1.79-1.60 (m, 4H), 1.58-1.47 (m, 3H), 1.45-1.35 (m, 1H)，1.08-0.98 (m, 1H)。MS: m/z 287 [M+Na]+。

2.514氯-13,14-脫氫槐定堿(化合物⑧)的制備 將化合物① 200 mg (0.6 mmol)、碳酸鋰 100 mg (1.4 mmol)和氯化鋰 50 mg(1.2 mmol)置于50 ml 圓底燒瓶中，加熱120 ℃反應(yīng)12 h，自然冷卻至室溫，加入100 ml 水，用50 ml × 3 CH2Cl2萃取，無(wú)水Na2SO4干燥，減壓濃縮濾液，經(jīng)硅膠柱層析分離，乙酸乙酯-石油醚(2∶1)洗脫，可得到亮黃色固體 150 mg，收率84%，mp 99 ～ 111 ℃，1H NMR(400 MHz, CDCl3): δ 6.60-6.62 (q, 1H,J= 3 Hz, 13-H), 3.80-3.84 (q, 1H,J= 6 Hz), 3.60-3.67 (m, 1H), 3.17-3.23 (dt, 1H,J= 6 Hz, 18 Hz), 2.88-2.91 (d, 1H), 2.77-2.83 (m, 1H), 2.59-2.66 (dt, 1H,J= 6 Hz, 18 Hz), 2.12-2.28 (m, 3H), 1.95-2.07 (m, 2H), 1.75-1.90 (m, 4H), 1.59-1.74 (m, 2H), 1.46-1.58 (m, 2H), 1.07-1.18 (m, 1H)。MS: m/z 303 [M+Na]+。

2.6體外抗腫瘤活性

2.6.1體外抗腫瘤活性篩選 用MTT法測(cè)試衍生物對(duì)HepG 2 (人肝癌細(xì)胞)、A549(人肺腺癌細(xì)胞)、HCT-8(人結(jié)腸癌細(xì)胞)、BGC 823(人胃癌細(xì)胞)、U 251(人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞)、SHG-44(人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞)、MS 751(人宮頸癌細(xì)胞)和WM-266-4(人黑色素瘤細(xì)胞)的體外抗腫瘤活性。收集生長(zhǎng)良好的腫瘤細(xì)胞，用含10%小牛血清的DMEM及RPMI 1640培養(yǎng)基分別配制成1.0～1.5×104/ml細(xì)胞懸液，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)接種，每孔100 μl，置37 ℃、5% CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后加藥，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照，受試樣品設(shè)3個(gè)濃度，每濃度3個(gè)平行孔，置37 ℃、5% CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)4 d。棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(0.4 mg/ml，無(wú)血清RPMI 1640配制)100 μl，37 ℃孵育4 h。棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，溶解Fomazan顆粒，輕度振蕩后，用550型酶標(biāo)儀在檢測(cè)波長(zhǎng)540 nm，參考波長(zhǎng)405 nm下測(cè)定OD值，并計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。結(jié)果見表1。

2.6.2不同濃度下化合物對(duì)胃癌BGC823的抑制活性 化合物濃度為100、200和400 μg/ml時(shí)對(duì)胃癌BGC823的抑制率，見表2。

表1 100 μg/ml濃度下化合物的對(duì)不同腫瘤的抑制活性

表2 不同濃度下化合物對(duì)胃癌細(xì)胞BGC823的抑制活性

a: 5-FU 濃度為10 μg/ml

3 結(jié)果與討論

3.1通過(guò)柱層析可分別將14α-氯槐定堿和14β-氯槐定堿這一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體分開，為了進(jìn)一步確定這兩個(gè)異構(gòu)體的14位具體構(gòu)型，試驗(yàn)中通過(guò)二維核磁結(jié)合其立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。通過(guò)NOESY譜圖可以看出，14α-氯槐定堿14位氫處于a鍵，該氫和13-Ha、13-He和12-Ha相關(guān)(圖2)。而14β-氯槐定堿14位氫處于e鍵，該氫與13-He和13-Ha都有相關(guān)，但與12-H無(wú)相關(guān)(圖3)。14-乙酰氧基槐定堿的制備是通過(guò)醋酸銫對(duì)14位氯的SN2取代完成的，這是一個(gè)構(gòu)型翻轉(zhuǎn)的反應(yīng)，因此得到的構(gòu)型正好與相應(yīng)的14-氯槐定堿構(gòu)型相反。14-乙酰氧基槐定堿通過(guò)甲醇鈉催化的醇解可得到14-羥基槐定堿，這是一個(gè)構(gòu)型保持的過(guò)程。

圖2 14α-氯槐定堿的立體結(jié)構(gòu)及其NOESY譜圖

圖3 14β-氯槐定堿的立體結(jié)構(gòu)及其NOESY譜圖

3.2合成的14位氯取代槐定堿衍生物①、②、③和⑧對(duì)胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和腦膠質(zhì)瘤的抑制活性均明顯高于槐定堿。二氯取代的化合物①對(duì)結(jié)腸癌和宮頸癌，以及14位為單氯取代的化合物②、③和⑧對(duì)黑色素瘤的抑制活性明顯優(yōu)于槐定堿及其他化合物。相同取代基不同構(gòu)型也會(huì)對(duì)活性產(chǎn)生影響，例如：14β-羥基衍生物⑥對(duì)肝癌、腦膠質(zhì)瘤和宮頸癌的抑制活性優(yōu)于α-羥基衍生物⑦，而對(duì)肺癌和胃癌的結(jié)果正好相反。14β-氯槐定堿③對(duì)宮頸癌具有一定抑制活性，而其α構(gòu)型基本沒(méi)有抑制活性。14單氯取代的衍生物②、③和⑧對(duì)胃癌的抑制活性隨著濃度增加而提高，尤其是14氯-13,14-脫氫槐定堿⑧，抑制率可達(dá)98%，明顯高于槐定堿。

3.3槐定堿注射液有顯著穩(wěn)定的臨床抗癌療效，但具有一定的神經(jīng)毒性，同時(shí)有報(bào)道已證實(shí)槐定堿在抗心律失常、保護(hù)心肌缺血、抗病毒、鎮(zhèn)痛等方面具有顯著藥理作用。因此，對(duì)槐定堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，減小槐定堿毒副作用，提高其活性，以期更有效和充分的利用槐定堿具有重要意義。

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