SKP2和p27kip1在放療后鼻咽癌CNE2細(xì)胞應(yīng)答中的作用

楊偉芳 孫曉南 丁維軍

●論 著

SKP2和p27kip1在放療后鼻咽癌CNE2細(xì)胞應(yīng)答中的作用

楊偉芳 孫曉南 丁維軍

目的 探討SKP2、p27kip1及細(xì)胞周期阻滯在放療后鼻咽癌細(xì)胞應(yīng)答中的作用。 方法 以人鼻咽低分化鱗癌CNE2細(xì)胞株作為研究對(duì)象，流式細(xì)胞儀檢測(cè)放療前后細(xì)胞周期變化，West blot檢測(cè)放療前后不同時(shí)間點(diǎn)SKP2及p27kip1表達(dá)的變化。 結(jié)果 放療后鼻咽癌CNE2細(xì)胞株出現(xiàn)G2/M期細(xì)胞周期阻滯，低劑量（2Gy）放療后0．5～1．5h出現(xiàn)SKP2表達(dá)短暫下降，同時(shí)伴p27kip1表達(dá)相應(yīng)增高；放療后4h出現(xiàn)SKP2表達(dá)升高而p27kip1表達(dá)下調(diào)。高劑量（6Gy）放療后1．5h內(nèi)出現(xiàn)SKP2表達(dá)升高，而放療后2～4h表達(dá)下降；而p27kip1表達(dá)在放療后0．5h出現(xiàn)短暫下降，1．5～4h表達(dá)上調(diào)，兩者之間關(guān)聯(lián)性不確定。 結(jié)論 SKP2、p27kip1和細(xì)胞周期阻滯參與放療后鼻咽癌CNE2細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)，且低劑量放療時(shí)，p27kip1表達(dá)可能受SKP2調(diào)控。

SKP2 p27kip1鼻咽癌 放射療法 細(xì)胞周期

鼻咽癌是東南亞及我國(guó)南方各省的常見病、多發(fā)病。放療是鼻咽癌的基本治療手段，但放療后局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是影響生存的主要因素。因此，對(duì)放療后細(xì)胞應(yīng)答機(jī)制的研究可能為鼻咽癌的治療帶來新的希望。S期激酶相關(guān)蛋白2（S-phase kinase-associated protein 2，SKP2）是泛素連接酶復(fù)合體（skp1/cullin/F-box,SCF）的關(guān)鍵組成成分，對(duì)細(xì)胞衰老、自噬、凋亡及DNA修復(fù)、放射敏感性、腫瘤形成、轉(zhuǎn)移等過程均有一定的調(diào)節(jié)作用[1-5]，有可能成為新的腫瘤治療靶點(diǎn)[6]。本實(shí)驗(yàn)以鼻咽癌CNE2細(xì)胞為對(duì)象，研究SKP2、p27kip1及細(xì)胞周期阻滯在癌細(xì)胞放療后應(yīng)答中的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人鼻咽癌CNE2細(xì)胞株購自中山大學(xué)細(xì)胞庫，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 主要儀器及試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品。SKP2和p27kip1抗體購自美國(guó)Cell Signaling公司。GAPDH抗體購自杭州賢至生物科技有限公司。RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒為美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)ECL KIT由GE Healthcare公司生產(chǎn)。Cell cycle staining solution為聯(lián)科生物公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品，直線加速器為西門子公司產(chǎn)品，型號(hào)Mevatron KD-2。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 在6Gy放療后0、6、12及24h分別收集約1×106個(gè)細(xì)胞，1 000r/min離心5min，棄去上清液，洗滌2次，加入-20℃70%冰乙醇2ml混勻固定，-20℃放置48h以上。檢測(cè)時(shí)，離心后棄乙醇，PBS洗滌2次，每106細(xì)胞中加入0.5ml PI染液，室溫避光染色30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Modifit Lt軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.4 West blot檢測(cè)SKP2及p27kip1蛋白表達(dá) 在放療（2Gy或6Gy）后0、0.5、1.5、2、4h收集CNE2細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白并測(cè)定蛋白濃度，各組取60μg蛋白上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2h后，分別用SKP2、p27kip1及GAPDH抗體室溫孵育2h(均為1∶1 000稀釋)，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，ECL避光顯影定影，結(jié)果采用Quantity One軟件進(jìn)行半定量分析。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料多組間比較采用方差分析，多組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)關(guān)系分析采用線性相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 CNE2細(xì)胞在6Gy放療后細(xì)胞周期變化 CNE2細(xì)胞在6Gy放療后出現(xiàn)G1期細(xì)胞比例下降，而S、G2/ M期細(xì)胞比例升高。放療前和放療后6、12、24h的G1、S和G2/M期細(xì)胞比例分別為73.46%、14.23%、12.31%；61.83%、20.11%、18.07%；62.20%、22.59%、15.20%和52.23%、27.16%、20.61%，組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），見圖1。

2.2 CNE2細(xì)胞放療后SKP2和p27kip1表達(dá)的變化

2.2.1 低劑量放療后SKP2和p27kip1表達(dá)的變化 低劑量（2Gy）放療后0.5～1.5h出現(xiàn)SKP2表達(dá)短暫下降，伴p27kip1表達(dá)相應(yīng)增高，放療后4h出現(xiàn)SKP2表達(dá)升高伴p27kip1表達(dá)下調(diào)。放療前后不同時(shí)間點(diǎn)SKP2和p27kip1表達(dá)存在差異，且兩者呈負(fù)相關(guān)（r=-0.9478，P＜0.05）。

2.2.2 高劑量放療后SKP2和p27kip1表達(dá)的變化 高劑量（6Gy）放療后1.5h內(nèi)出現(xiàn)SKP2表達(dá)升高，而2～4h后SKP2表達(dá)下降；而p27kip1在放療后0.5h出現(xiàn)短暫下降，1.5～4h后表達(dá)上調(diào)。放療后不同時(shí)間點(diǎn)SKP2和p27kip1表達(dá)也存在差異，但兩者之間無明確相關(guān)關(guān)系（r=-0.5863，P＞0.05），見圖2，圖內(nèi)數(shù)據(jù)為半定量結(jié)果。

3 討論

圖1 6Gy放療前后CNE2細(xì)胞的細(xì)胞周期分布

圖2 CNE2細(xì)胞放療后SKP2及p27kip1表達(dá)變化

在東南亞，每年鼻咽癌的發(fā)病率約為10～15/100 000人，而其中非角化性低分化或未分化癌約占總數(shù)的95%[7-8]。放療是鼻咽癌的基本治療手段，但對(duì)中晚期及進(jìn)展期患者療效卻不甚理想，且放療后往往出現(xiàn)多種不良反應(yīng)，影響患者的生活質(zhì)量。因此，探討新的治療靶點(diǎn)有可能為鼻咽癌患者的治療帶來新的希望。

SKP2是SKP2-SCF復(fù)合體的基質(zhì)識(shí)別亞單位，因其能與細(xì)胞周期蛋白cyclin A作用而被Beach等[9]于1995年首先發(fā)現(xiàn)。SKP2-SCF復(fù)合體可以通過誘導(dǎo)泛素化及依賴于蛋白酶體對(duì)p27及其他底物的降解而發(fā)揮作用[6]。研究顯示SKP2具有多種細(xì)胞調(diào)節(jié)功能，包括調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展、衰老、影響DNA修復(fù)、放射敏感性、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等[1-5]。首先，它在泛素介導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases,CDK）抑制劑p27kip1的降解中起作用，通過影響p27的穩(wěn)定性從而最終影響細(xì)胞周期進(jìn)展。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)在DNA損傷修復(fù)、放射敏感性中具有重要作用，而SKP2是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期發(fā)展的關(guān)鍵因子之一[2，10]。其次，SKP2還和細(xì)胞衰老相關(guān)。盡管單純的SKP2失活并不能誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，但SKP2缺失伴有異常的促腫瘤信號(hào)或腫瘤抑制基因滅活時(shí)確實(shí)能引起強(qiáng)有力的抑制腫瘤的衰老應(yīng)答,其部分通過對(duì)p27kip1的表達(dá)調(diào)控實(shí)現(xiàn)[6]。另外，SKP2表達(dá)可能還與放射敏感性相關(guān)，研究顯示SKP2誘導(dǎo)表達(dá)可以促進(jìn)食管癌EC9706細(xì)胞的放射抵抗性，而SKP2基因敲除則可以增強(qiáng)腫瘤放射敏感性[11]。最新研究報(bào)道，SKP2還具有致癌活性，通過誘導(dǎo)具有抗增殖活性和腫瘤抑制功能的蛋白的降解（如p27kip1等），從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生形成[3]。許多人類腫瘤標(biāo)本中SKP2的過表達(dá)往往與不良預(yù)后相關(guān)，且其與p27kip1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[2]。鼻咽癌中SKP2表達(dá)升高亦與不良預(yù)后相關(guān)[12-13]，但目前國(guó)內(nèi)外尚無鼻咽癌細(xì)胞株放療后SKP2表達(dá)變化的相關(guān)報(bào)道。

p27kip1是調(diào)節(jié)G1/S轉(zhuǎn)化的CDK抑制劑，作為腫瘤抑制因子，是SKP2主要的生理性和病理性作用底物。p27kip1表達(dá)升高可以導(dǎo)致G1期細(xì)胞周期阻滯，而表達(dá)下調(diào)則可以促進(jìn)G1/S轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展。p27kip1主要通過翻譯后修飾調(diào)節(jié)，由SCF復(fù)合體介導(dǎo)的泛素-蛋白酶系統(tǒng)降解。有研究報(bào)道在放射誘導(dǎo)的DNA損傷中，p27kip1蛋白水平短暫升高，隨之發(fā)生G1期細(xì)胞周期阻滯從而利于DNA損傷的修復(fù)[14]。

本研究中，CNE2細(xì)胞在6Gy放療后G1期細(xì)胞比例下降，而S期和G2/M期細(xì)胞比例升高，出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯。說明細(xì)胞周期調(diào)節(jié)在鼻咽癌細(xì)胞放療后應(yīng)答中起重要作用。研究報(bào)道DNA損傷后通過激活A(yù)TM、ATR激酶使其下游效應(yīng)器蛋白磷酸化，激活細(xì)胞周期檢查點(diǎn)（G1/S、intra-S、G2/M等），引起細(xì)胞周期阻滯，并啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而維持基因穩(wěn)定性。在腫瘤干細(xì)胞中，檢查點(diǎn)途徑是放射抵抗的主要機(jī)制之一，對(duì)于放射抵抗的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，通過抑制檢查點(diǎn)途徑可以逆轉(zhuǎn)其放射抵抗性[10]。

本研究結(jié)果提示低劑量放療后0.5～1.5h出現(xiàn)SKP2表達(dá)短暫下降伴p27kip1表達(dá)相應(yīng)增高，放療后4h出現(xiàn)SKP2表達(dá)升高伴p27kip1表達(dá)下調(diào)，兩者之間存在負(fù)相關(guān)。因CDK抑制劑p27kip1的表達(dá)高低與細(xì)胞周期進(jìn)展密切相關(guān)，而SKP2可以通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)節(jié)p27kip1的降解從而影響p27kip1的穩(wěn)定性，最終影響細(xì)胞周期進(jìn)展；反之，SKP2失活可以上調(diào)p27kip1表達(dá)從而引起細(xì)胞周期阻滯[2]。綜合既往的研究結(jié)果，筆者推測(cè)SKP2和p27kip1參與放療后鼻咽癌CNE2細(xì)胞的損傷應(yīng)答，且p27kip1的表達(dá)變化可能受SKP2調(diào)控。

本研究還顯示在高劑量放療后SKP2和p27kip1表達(dá)亦存在變化，但與低劑量時(shí)不同，兩者表達(dá)無明確相關(guān)關(guān)系，其在變化的時(shí)間點(diǎn)與低劑量時(shí)亦有差別。說明高劑量放療引起的DNA損傷應(yīng)答途徑可能不同于低劑量照射，具體的損傷應(yīng)答途徑尚需進(jìn)一步研究明確。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示鼻咽癌CNE2細(xì)胞在放療后出現(xiàn)G2/M期細(xì)胞周期阻滯，而SKP2和p27kip1參與其放療后應(yīng)答反應(yīng)，且低劑量放療時(shí)，p27kip1表達(dá)可能受SKP2調(diào)控。SKP2對(duì)不同劑量放療的具體應(yīng)答機(jī)制及其與放射誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞衰老等的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究明確。

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SKP2 and p27kip1are involved in cellular response to radiation in human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2

SKP2 p27kip1Nasopharyngeal carcinoma Radiation Cell cycle

2012-12-17）

（本文編輯：胥昀）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009A221）

310016 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院放療科（楊偉芳、孫曉南，楊偉芳系在職碩士研究生，現(xiàn)在溫州醫(yī)學(xué)院附屬臺(tái)州醫(yī)院放療科工作）；溫州醫(yī)學(xué)院附屬臺(tái)州醫(yī)院放療科（丁維軍）

孫曉南，E-mail:sunxiaonan@hotmail.com

【 Abstract】Objective To investigate the expression of SKP2 and p27kip1in the cellular response to radiation in human nasopharyngeal carcinoma cells CNE-2． Methods The expressions of SKP2 and p27kip1in human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 cells were detected by Western blot before and after ionizing radiation．Flow cytometry was used for cell cycle Analysis．Results The CNE2 cells displayed a G2/M cell-cycle arrest after exposure to radiation．Western blot analysis showed a transient increasd expression of p27kip1and decreased expression of Skp2 at 0．5～1．5h after exposure to low doses ionizing radiation(2Gy); meanwhile 2～4h after exposure to low dose radiation the expression of Skp2 was up-regulated and p27kip1down-regulated．However,the expressions pattern of SKP2 and p27kip1were reversed to above observation after exposure to high doses ionizing radiation(6Gy)．Conclusion The results suggest that SKP2 may contribute to the regulation of p27kip1and may be a key factor in regulating the cell cycle in response to radiation-induced DNA damage．