制備型液相色譜法及其在制藥和天然產(chǎn)物分離中的應(yīng)用

李洪彬 周建民 劉 艷

0 引言

色譜法分離是20世紀(jì)60年代誕生的一種高效分離純化技術(shù)。其利用組分在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)的微小差異，當(dāng)兩相作相對運(yùn)動(dòng)時(shí)，不同組分將形成不同遷移速度的譜帶，使組分彼此分離，從而達(dá)到分離的目的。

制備型高效液相色譜（preparative high performance liquid chromatography，Prep-HPLC）是一種使用高壓、恒流輸液泵系統(tǒng)在高分辨率、大直經(jīng)、高載量分離柱上進(jìn)行樣品高純度分離的液相色譜制備方法。該方法分離的產(chǎn)品在純度、回收率、分離效果等方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的制備方法，因此在制藥、天然產(chǎn)物的分離領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。對于那些用常規(guī)方法難以分離的產(chǎn)物、熱敏性物系以及具有生物活性物系的分離，色譜法具有獨(dú)特的優(yōu)越性。本文就近年來Prep-HPLC方法的研究進(jìn)展及其在制藥和天然產(chǎn)物分離中的應(yīng)用作一綜述。

1 制備型高效液相色譜概述

1.1 Prep-HPLC的工作原理及特點(diǎn)

Prep-HPLC的原理是基于20世紀(jì)60年代誕生的色譜法分離，其利用組分在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)的微小差異，當(dāng)兩相作相對運(yùn)動(dòng)時(shí)，不同組分將形成不同遷移速度的譜帶，使組分彼此分離，從而達(dá)到分離的目的。與其他分離手段相比，Prep-HPLC具有以下特點(diǎn)：

（1）采用高柱效色譜柱，分離效率高；

（2）可以根據(jù)工藝需要自行裝柱，采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱裝柱，操作簡單，裝填的柱效高；

（3）應(yīng)用范圍廣，對極性和非極性、離子型和非離子型、小分子和大分子、熱穩(wěn)定性和熱不穩(wěn)定性化合物均具有較好的分離效果；

（4）根據(jù)分離化合物的性質(zhì)可配備不同類型的檢測器，如紫外檢測器（UV）、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）、二極管陣列檢測器（DAD）；

（5）可進(jìn)行工業(yè)級大量生產(chǎn)，進(jìn)樣量大，可連續(xù)進(jìn)樣、生產(chǎn)，完成克級至千克級樣品的分離。

1.2 Prep-HPLC和分析型HPLC的區(qū)別

HPLC按照操作方式和目的的不同可分為分析型和制備型2類。分析型是以分離、鑒別及鑒定為目的，不需要對樣品進(jìn)行回收；Prep-HPLC是從混合物中分離得到純化合物，是一個(gè)純化過程，上樣量大，通常需要特定的裝置和一定的操作條件。

1.3 Prep-HPLC的分類

Prep-HPLC根據(jù)待分離樣品的量可分為2類，一類為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備，另一類為工業(yè)生產(chǎn)型規(guī)模制備。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備屬于做研發(fā)階段的小試或中試實(shí)驗(yàn)，但也有因?yàn)樾枰臉悠妨亢苌俣扇?shí)驗(yàn)室規(guī)模制備的，樣品量為毫克級，分離的樣品一般進(jìn)行生物活性測定、結(jié)構(gòu)鑒定，以及作為標(biāo)準(zhǔn)品等。這類色譜分離中，經(jīng)濟(jì)效益并不是首要考慮的問題，其對設(shè)備精度要求比較高，要達(dá)到一定的精度要求，方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對于工業(yè)生產(chǎn)型制備高效液相色譜，經(jīng)濟(jì)效益是其整個(gè)純化過程考慮的核心因素，純化樣品量為克級至千克級。這類色譜要求達(dá)到預(yù)期的分離目的，必要時(shí)候還要求對溶劑回收利用，避免污染環(huán)境。

1.4 影響Prep-HPLC分離的因素

影響Prep-HPLC分離純化的因素有很多，包括色譜柱的柱徑、柱長、填料尺寸、上樣量以及流動(dòng)相的組成、流速等。

1.4.1 色譜柱尺寸的影響

王志祥等考察了柱子尺寸對柱效和分離度的影響，認(rèn)為增加柱子長度可以提高分離效果，但相應(yīng)柱壓也會(huì)增大。為了提高制備量，可以使用內(nèi)徑較大的制備柱，但隨著色譜柱直徑的增大，會(huì)產(chǎn)生柱放大效應(yīng)，使得柱效降低，導(dǎo)致總分離效果下降。

Koh和Guiochon等在動(dòng)態(tài)軸向壓縮條件下研究了色譜柱長度對Prep-HPLC分離效果的影響。在相同的壓縮強(qiáng)度、裝填材料、調(diào)漿溶劑等條件下，隨著色譜柱的加長，柱內(nèi)軸向壓力分布的范圍變大，柱越長，活塞與相反一端的壓力差就會(huì)越大，形成的柱床越不穩(wěn)定、不均勻，裝填密度會(huì)越小，從而導(dǎo)致色譜柱產(chǎn)生軸向的壓力梯度和密度梯度。同時(shí)，色譜柱越長，空隙率就越大。在裝填過程中，一系列的塌陷主要發(fā)生在壓縮開始的幾秒鐘內(nèi)，此時(shí)，床層高度突然而迅速地降低，然后床層的降低變慢。色譜柱越長，發(fā)生局部塌陷的機(jī)會(huì)就越多，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)的時(shí)間就越長。

目前，Prep-HPLC裝填的色譜柱長度一般為100～400 mm，在滿足分離度的前提下，應(yīng)盡量使用較短的制備柱。具體柱子的長度和內(nèi)徑要根據(jù)待分離樣品的性質(zhì)，通過做實(shí)驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證進(jìn)行選擇。

1.4.2 色譜填料的影響

在Prep-HPLC中，填料的形狀對柱子性能有很大的影響。對于球形填料，填裝能迅速且平滑地達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，對于形狀不規(guī)則填料填裝過程中的床層塌陷不可預(yù)測（尤其是當(dāng)填料微粒較大時(shí)），裝填情況非常復(fù)雜。不規(guī)則填料受壓力的影響較大，當(dāng)壓力較大時(shí)，會(huì)有部分微粒發(fā)生破碎，從而引起柱長降低，柱壓降隨之變大。而且，不規(guī)則填料在整個(gè)壓縮過程中都會(huì)有微粒發(fā)生破碎，這種現(xiàn)象與床層內(nèi)壓力的分布不均和微粒形成亞穩(wěn)狀態(tài)有關(guān)。顯然，這樣就無法確定床層是處于穩(wěn)態(tài)還是亞穩(wěn)態(tài)。如果床層處于亞穩(wěn)態(tài)，任何振動(dòng)都會(huì)引起進(jìn)一步塌陷。當(dāng)填料不規(guī)則或內(nèi)孔體積較大時(shí)，要采用較小的壓縮壓力。用球形填料裝填得到的柱長的增量與所用干填料的質(zhì)量增量幾乎成直線關(guān)系，而不規(guī)則微粒裝填得到的柱長的增量要比干填料的質(zhì)量增量大，這是因?yàn)榍蛐挝⒘Ｒ炔灰?guī)則微粒填裝的緊密，可壓縮性小。而且，微粒越大裝填密度就會(huì)越小，越不穩(wěn)定，越容易破碎，導(dǎo)致床層壓降增大，柱效降低。

1.4.3 裝柱技術(shù)的影響

傳統(tǒng)的裝柱法有干法和濕法裝柱。在20世紀(jì)70年代，人們開始嘗試動(dòng)態(tài)軸向壓縮裝柱法（DAC）。現(xiàn)在DAC裝柱已基本上主宰了整個(gè)制備型色譜柱市場，聊城萬合工業(yè)制造有限公司生產(chǎn)的Prep-HPLC就是采用DAC技術(shù)，柱徑為50～1 000 mm，裝填的色譜柱床均勻、性能穩(wěn)定、柱效高。

1.4.4 上樣量的影響

Prep-HPLC為了提高柱產(chǎn)量，一般采用柱超載方式進(jìn)行操作。提高處理量可以采用2種操作方式：一種是使用小的注入體積，但增加樣品濃度，即所謂的“質(zhì)量超載”；另一種是保持較小的樣品濃度，但增加樣品體積，即所謂的“體積超載”。在滿足分離度要求的前提下，可以采用柱超載方式操作，以提高制備量。當(dāng)一次操作所需要處理的樣品較少時(shí)，采用“質(zhì)量超載”方式更為有利；當(dāng)一次操作所要處理的樣品的量較多時(shí)，采用“體積超載”方式更為有利。

除上述因素外，柱子配流板形狀、樣品黏度、流動(dòng)相流速、壓縮壓力等因素都會(huì)對柱效有所影響，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)并通過反復(fù)試驗(yàn)找到合適的分離方法是和每一個(gè)色譜分離工作者的勤奮工作分不開的。

2 Prep-HPLC在制藥和天然產(chǎn)物分離中的應(yīng)用

2.1 在標(biāo)準(zhǔn)品制備中的應(yīng)用

市售的雌三醇試劑，考慮到一般性用途及其成本，在常規(guī)生產(chǎn)中不可能精制得相當(dāng)純，而免疫分析用的雌三醇標(biāo)準(zhǔn)品關(guān)系到測定樣品中抗原含量的正確定量問題，要求標(biāo)準(zhǔn)品具有高純度，無交叉物存在。楊蘭萍等采用上海第十二制藥廠提供的中間產(chǎn)品雌三醇，用制備型液相色譜制備得到雌三醇的免疫分析用標(biāo)準(zhǔn)品，在制備過程中，通過反復(fù)試驗(yàn)，研究了進(jìn)樣量、進(jìn)樣體積對分辨率、峰形的影響及對產(chǎn)品純度的影響，總結(jié)出一套合適的制備方法，此方法制備量大，可用于研究和生產(chǎn)領(lǐng)域。

茶氨酸是影響茶葉品質(zhì)的重要組成部分，約占茶葉中游離氨基酸的40%以上，占茶葉干重的1%～2%。藥理學(xué)研究表明茶氨酸能拮抗咖啡堿引起的神經(jīng)系統(tǒng)興奮，同時(shí)具有降壓作用。隨著茶氨酸的保健功效逐漸為人們所認(rèn)識(shí)，市場對茶氨酸的需求不斷上升。目前，國內(nèi)僅有少量的茶氨酸對照品，且價(jià)格昂貴，限制了對其進(jìn)一步的研究和應(yīng)用。肖偉濤等采用制備型高效液相色譜技術(shù)分離純化茶氨酸對照品，純度達(dá)到98%以上，制備收率大于80%。

2.2 在蛋白質(zhì)和多肽分離制備中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)和肽類藥物活性強(qiáng)，生物功能明確，特異性高，有利于臨床應(yīng)用，已成為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的一大類重要產(chǎn)品。這些產(chǎn)品無論是來自于生物體內(nèi)還是由化學(xué)合成，往往都帶有復(fù)雜的混合成分，而總目的蛋白或肽類的豐度又低，給分離純化帶來困難，需要多種方法聯(lián)合使用以獲得純度滿意的產(chǎn)品。在此過程中，Prep-HPLC通常在分離的最后階段被用作獲得高純度產(chǎn)品的關(guān)鍵方法。

使用Prep-HPLC制備前，蛋白質(zhì)和肽類樣品一般先經(jīng)過傳統(tǒng)分離純化方法，如鹽析、超濾法、凝膠過濾、等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析及親和層析等，預(yù)先提高純度，然后再進(jìn)行高純度制備。使用比較普遍的色譜柱是烷基反相鍵合相柱，如C18、C8及C4等，具體選擇因蛋白質(zhì)相對分子量或疏水性而定。流動(dòng)相大多為甲醇或乙腈等有機(jī)相與水的混合體系，通常還添加三氟醋酸（trifluoroacetic acid，TFA）以增加樣品的溶解度。黃鶴等用C18柱對經(jīng)離子交換層析后的胸腺素α-1（T細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑，為酸性較強(qiáng)的28肽）半純品進(jìn)行了純化，流動(dòng)相采用0.1%TFA/水和0.1%TFA/90%乙腈溶液梯度系統(tǒng)，可將制備前約65%的純度提高到95%以上，回收率可達(dá)80%。韓香等報(bào)道用不同的梯度條件，最終產(chǎn)品純度甚至高達(dá)98.8%以上。

2.3 Prep-HPLC在生物堿分離制備中的應(yīng)用

生物堿是自然界中廣泛存在的一大類堿性含氮化合物，是許多中草藥的重要有效成分，在中性或酸性條件下以正離子形式存在。通常，人們用陽離子交換樹脂從其提取液中富集分離生物堿。但是由于植物中含有的生物堿成分復(fù)雜、含量低，因此分離比較困難。Prep-HPLC在生物堿分離制備中應(yīng)用最普遍的是反相制備方法，流動(dòng)相根據(jù)樣品的不同而有很大差異。

紫杉醇是從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）中提取或半合成的具有抗癌活性的二萜生物堿，屬于廣譜抗腫瘤藥物，臨床應(yīng)用比較廣泛。但短葉紅豆杉資源珍貴，其提取物中紫杉醇的含量極低（0.000 4%～0.01%），且含有大量的植物蠟、色素和樹膠等雜質(zhì)，因而無論是從天然植物紅豆杉中還是從培養(yǎng)的植物細(xì)胞組織及微生物發(fā)酵液中提取紫杉醇，都涉及到如何分離并去除與紫杉醇結(jié)構(gòu)相似的其他紫杉烷類化合物的問題。制備液相是紫杉醇純化應(yīng)用中的重要手段，并有專用于制備紫杉醇的紫杉醇專用柱。Yang等將經(jīng)過預(yù)處理的4 800 g云南紅豆杉樹皮粗提物用以D956樹脂為填料的工業(yè)制備液相色譜柱（250 mm×200 mm）分離，以丙酮/水=40/60～58/42為流動(dòng)相梯度洗脫，最終制備出約50 g紫杉醇，純度達(dá)到99%，回收率在80%以上。

3 Prep-HPLC與其他分離技術(shù)的聯(lián)用

3.1 Prep-HPLC與大孔吸附樹脂技術(shù)的聯(lián)用

大孔吸附樹脂是一類不含交換基團(tuán)，且具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大表面積的高分子吸附樹脂。大孔吸附樹脂技術(shù)在中藥化學(xué)成分的提取、分離、富集過程中具有獨(dú)特的優(yōu)勢作用，可有效提高中藥內(nèi)在質(zhì)量和制劑水平，降低產(chǎn)品的吸潮性并去除重金屬殘留。提取物經(jīng)大孔吸附樹脂處理后，可去除多糖、蛋白質(zhì)及雜質(zhì)，再通過Prep-HPLC分離即可得到單體化合物，使分離純化過程更加快速、高效，大大節(jié)省溶劑的使用量。Zhang等通過大孔吸附樹脂分離并富集了竹葉中的抗氧化物（AOB），再以乙腈21%乙酸水溶液（18B85）為流動(dòng)相，采用Prep-HPLC從5 L的AOB濃縮液（含粗品615 g）中分離制備了葒草素（49 mg）、異葒草素（142 mg）、牡荊黃素（15 mg）和異牡荊黃素（62 mg）4種黃酮碳苷類成分。

3.2 Prep-HPLC與超臨界CO2萃取技術(shù)的聯(lián)用

超臨界CO2萃取技術(shù)（SFE）是一種新型的提取分離技術(shù)，具有操作溫度低、從萃取到分離可一步完成、CO2可循環(huán)使用且產(chǎn)品純度和收率高等優(yōu)點(diǎn)。將SFE和Prep-HPLC聯(lián)用，可使天然產(chǎn)物中有效成分純化過程更為環(huán)保、快速、高效。

Rochfort等采用SFE和Prep-HPLC聯(lián)用技術(shù)，從3 g花莖甘藍(lán)種子中分離得到1 716 mg蘿卜苷（glucora2 phanin）。技術(shù)條件為：C18制備色譜柱（250 mm×10 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈20%甲酸水溶液；SFE的萃取率為16%。

4 結(jié)語

Prep-HPLC是制備純化天然產(chǎn)物的一種有效手段，具有產(chǎn)品純度高、產(chǎn)率高、分離速度快等優(yōu)點(diǎn)。其未來的發(fā)展趨勢是大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，現(xiàn)在的技術(shù)已經(jīng)有了很大提高，無論在設(shè)備研發(fā)還是在技術(shù)工藝開發(fā)方面都有了長足的進(jìn)步。在設(shè)備研發(fā)方面，聊城萬合工業(yè)制造有限公司生產(chǎn)的DAC制備柱和高壓恒流輸液泵已經(jīng)能滿足絕大部分用戶的需求，國內(nèi)有很多制藥行業(yè)的研發(fā)人員也積極參與到制備工藝的研發(fā)中，通過樣品的分析條件向制備條件的放大工藝也日趨成熟。

我國的天然產(chǎn)物分布廣泛，種類繁多，對它們的組分結(jié)構(gòu)與生理活性關(guān)系的研究以及對天然產(chǎn)物的綜合利用是當(dāng)今非常令人感興趣的課題。這就要求我們對其成分的分離過程做到至純至微，為此我們必須將各種分離手段結(jié)合起來，比如可以和大孔吸附樹脂或超臨界提取聯(lián)合使用，并最終用高分辨率的設(shè)備將其一一分離鑒定。在此過程中，Prep-HPLC由于具有分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，在將來勢必會(huì)成為天然產(chǎn)物分離方面的重要手段之一。（興業(yè)杯參賽論文）

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