三種針法對快速老化癡呆模型小鼠老化度評分及行為學影響研究

羅本華　張雪竹　趙嵐　張榮超　韓景獻　于建春

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是伴隨機體衰老而出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)慢性、退行性病變，臨床上以記憶減退、認知障礙和人格改變?yōu)樘卣鳌？焖倮匣V呆模型小鼠(senescence-accelerated mice prone 8, SAMP8)是自然發(fā)病的老年性癡呆模型，與同源的抗快速老化亞系小鼠(senescence accelerated mouse resistance 1，SAMR1)比較有明顯的老化特征，老化評分明顯增高，也存在明顯的學習記憶障礙。本實驗以SAMP8為研究對象，SAMR1為正常對照，以本課題組有長期臨床與實驗研究基礎的“益氣調(diào)血、扶本培元”針法(針刺腹穴組)為基礎干預方法，又擬以動物試驗先行背俞穴組及腹背配穴組的干預方法，檢測SAMP8癡呆動物模型的老化評分及水迷宮行為學的影響，比較研究三種不同干預針法的療效異同，進行“從三焦氣化失司論治癡呆”及“益氣調(diào)血，扶本培元”治則為基礎的配方組穴優(yōu)選方案探討。

1　材料和方法

1.1　研究對象

健康雄性8月齡SAMR1 12只和雄性8月齡SAMP8 60只，由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物中心提供(天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物中心自繁殖，自己應用，沒有批號)。

1.2　動物分組

所有實驗動物共分6組。按隨機數(shù)字表法隨機將60只SAMP8分為5組，即SAMP8對照組12只、針刺腹穴組12只、針刺背俞穴組12只、針刺腹背穴組12只、針刺非穴組12只，以及12只SAMR1為SAMR1對照組。

實驗前各組小鼠的出生天數(shù)與體重因素比較如下：(1)出生天數(shù)均為8月齡，經(jīng)方差分析顯示各組間差異無統(tǒng)計學意義。(2)SAMR1對照組平均體重為(33.58±1.04)g，SAMP8對照組(29.4±1.85)g，針刺腹穴組(30.05±1.32)g，針刺背俞穴組(30.05±1.04)g，針刺腹背穴(29.86±1.58)g，針刺非穴組(29.7±1.89)g。t檢驗顯示SAMR1小鼠與SAMP8小鼠比較P≤0.01，差異有統(tǒng)計學意義，SAMR1有體重優(yōu)勢；而單因素方差分析顯示SAMP8各組間差異無統(tǒng)計學意義，提示SAMR1小鼠存在體重優(yōu)勢，可能對水迷宮成績有一定的影響。SAMP8的體重差異是由SAMR1基因自然變異經(jīng)篩選出的SAMP8系列，是群體固有的，二者是國際公認兩種研究對照鼠模型。

1.3　處理方法

針刺腹穴組選取膻中、中院、氣海及雙側(cè)血海、足三里，穴位定位根據(jù)《動物針灸穴位圖譜》[1]。針刺方法：膻中、中脘、氣海、足三里穴分別施捻轉(zhuǎn)補法30秒，血海穴施捻轉(zhuǎn)瀉法30秒。針刺背俞穴組選取雙側(cè)肺俞穴、脾俞穴和腎俞穴，均針0.05～0.1 cm，分別施捻轉(zhuǎn)補法30秒。針刺腹背穴組是取以上腹穴和背俞穴組，按以上操作。針刺非穴組取雙側(cè)脅下固定非穴點，作為對照刺激點，行平補平瀉捻轉(zhuǎn)手法各30秒。SAMP8對照組和SAMR1對照組施加與針刺組相同程度的捉抓。各組每天做相應處理1次，第8天停1次，連續(xù)14次。第15天休息1次，第16天上下午各行水迷宮訓練1次，每次90秒；接下來10天每天均先行針刺相應穴位及相應治療后，休息至少1小時以上，接著每隔4小時各做水迷宮1次，每天行2次水迷宮治療。

1.4　實驗方案

1.4.1老化度評分老化度評分標準依外在形體及行為的老化改變，客觀地給動物評分。包括反應性、被動性逃避反應、皮毛光澤、皮毛粗糙程度、脫毛程度、皮膚潰病、眼周損害、角膜混濁、角膜潰瘍、白內(nèi)障、脊柱后凸等11項指標，每項指標再劃分為3～5級不同等級，標定分值。積分越高則老化度越高。

1.4.2行為學測試Morris水迷宮參照文獻制作[2-4]。實驗時，一攝像頭置于水迷宮水池中央的上方約2 m處，自動采集動物游泳圖像，所收集信號直接輸入計算機，由圖像自動采集和分析系統(tǒng)(中國醫(yī)學科學院藥物研究所提供)自動分析和處理，包括動物的逃避潛伏期、游泳路徑、不同象限的停留時間、穿越原平臺的次數(shù)、初始角度及游泳路線的長度、搜索策略及中、外環(huán)游泳距離百分比等參數(shù)。水迷宮實驗方法與操作參考文獻進行[5]。試驗前1天，讓動物在不含平臺的水池中自由游泳90秒，上午、下午各一次，使其熟悉迷宮環(huán)境；實驗程序包括第1至第5天共5天的隱蔽平臺試驗，第6天為探索試驗，第7至第9天共3天反向試驗及第10天的可視平臺試驗[5-6]，以評價SAMR1和SAMP8學習記憶能力的變化。

1.5　數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

老化度評分數(shù)據(jù)處理：使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，采用ANOVA方差分析。P≤0.05為檢驗顯著性差異水準。

實驗后由于各組有不同數(shù)量的小鼠脫落，最后統(tǒng)計數(shù)據(jù)為SAMR1對照組12只、SAMP8對照組10只、針刺腹穴組10只、針刺背俞穴組11只、針刺腹背穴11只、針刺非穴組10只。

2　結(jié)果

2.1　老化度評分

實驗前后SAMP8各組和SAMR1的老化度評分結(jié)果見表1。

治療前老化評分值經(jīng)單因素方差分析方差為F(5,58)=59.365，P<0.01，組間差異有統(tǒng)計學意義，SAMP8各組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義。SAMR1對照組與SAMP8各組比較P<0.01(t檢驗結(jié)果相同)，而SAMR1評分明顯低于SAMP8各組，說明8月齡的SAMR1小鼠衰老程度低于8月齡SAMP8小鼠，且從老化評分看，SAMP8小鼠已呈現(xiàn)迅速老化特征。

治療后老化評分經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)(5,58)=64.81，P<0.01，組間差異有統(tǒng)計學意義，而諸組間兩兩比較顯示，SAMR1對照組與SAMP8各組比較均

表1　實驗前后SAMP8和SAMR1的老化度評分結(jié)果

注：與SAMP8對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與針刺非穴組比較，cP<0.01；與SAMR1對照組比較，dP<0.01

P<0.01；而針刺腹穴組、針刺腹背穴組分別與SAMP8對照組和針刺非穴組比較，均P<0.01，差異有統(tǒng)計學意義；針刺背俞穴組與SAMP8對照組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，而與針刺非穴組比較差異無統(tǒng)計學意義；三種針方法間差異無統(tǒng)計學意義。三種針刺組自身前后經(jīng)配對t檢驗示：針刺腹穴組治療后老化分值降低(t=2.862,P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；針刺腹背穴組治療后老化分值降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.194,P<0.01)；針刺背俞穴組(t=2.170,P>0.05)治療前后老化分值差異無統(tǒng)計學意義。SAMP8對照組和針刺非穴組實驗處理前后沒有變化。以SAMP8對照組為對照，針刺腹穴組、針刺背俞穴組及針刺腹背組三種針刺治療后老化分值均有不同程度的降低。因此，三種針刺方法均對抵抗SAMP8小鼠快速老化進程及改善老化評分有一定的作用， 腹穴和腹背穴針刺組有相對肯定的療效優(yōu)勢。

2.2　行為學研究結(jié)果

2.2.1隱蔽平臺試驗在連續(xù)5天(第1天至第5天)的隱蔽平臺試驗中，雙因素方差分析檢驗結(jié)果為F(5,58)=12.447，P<0.01，所有8月齡SAMR1和SAMP8小鼠的逃避潛伏期均隨訓練天數(shù)的增加而明顯縮短，學習成績穩(wěn)步提高，反映針刺治療和水迷宮的訓練有顯著性的改善學習和記憶作用；交互作用檢驗為F(20,232)=1.016，P<0.05，說明訓練天數(shù)與組間因素沒有交互作用；而諸組間總體比較的方差為F(5,58)=23.188，P<0.01，說明諸組間總體有顯著性差異。諸組間詳細兩兩比較發(fā)現(xiàn)：(1)SAMP8對照組的平均潛伏期下降緩慢而SAMR1對照組下降明顯，于第二天二者就出現(xiàn)顯著性的差異；(2)三個針刺組中，針刺背俞穴組最早于第二天出現(xiàn)比SAMP8對照組和針刺非穴組更短的顯著性差異平均潛伏期，但此后療效不穩(wěn)定；(3)從第3天到第5天，針刺腹穴組和針刺腹背穴組的逃避潛伏期均較SAMP8對照組和針刺非穴組更短，有顯著性差異，且療效穩(wěn)定，而SAMP8對照組與針刺非穴組沒有差異；(4)雖然三個針刺組間，平均潛伏期時間呈現(xiàn)“針刺腹背穴組<針刺腹穴組<針刺背俞穴組”的趨勢。實驗結(jié)果提示：SAMP8小鼠存在學習記憶獲得方面的認知損害，而三個針刺方法都能顯著地改善這種認知功能損害且具有穴位特異性；其中，針刺背俞穴組起效早但療效不穩(wěn)定。由此，課題組認為針刺腹穴組、針刺腹背穴組是可能的優(yōu)選方法。各組小鼠在水迷宮中的平均逃避潛伏期時間見表2第1天至第5天數(shù)據(jù)。

2.2.2反向試驗反向試驗見表2第7天至第9天數(shù)據(jù)。在連續(xù)3天的反向試驗中，雙因素方差分析檢驗結(jié)果為F(5,58)=4.732，P<0.05，所有8月齡SAMR1和SAMP8小鼠的逃避潛伏期時間均隨訓練天數(shù)的增加而逐漸下降趨勢，再學習成績穩(wěn)步提高，反映針刺治療和水迷宮的訓練有顯著性的改善再學習和記憶作用；交互作用檢驗為F(10,116)=1.342，P<0.05，說明訓練天數(shù)與組間因素之間沒有交互作用；而諸組間總體比較的方差為F(5,58)=4.02,P<0.01，說明諸組間總體差異有統(tǒng)計學意義。組間因素詳細兩兩比較發(fā)現(xiàn)：(1)SAMP8對照組和針刺非穴組的逃避潛伏期時間下降緩慢，而SAMR1對照組下降顯著；于第8天，SAMP8對照組的逃避潛伏期比SAMR1對照組、針刺腹穴組均長，差異有統(tǒng)計學意義；(2)于第9天，針刺腹背穴組的平均潛伏期也比SAMP8對照組和針刺非穴組更短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；(3)三個針刺組中，針刺腹背穴組和針刺腹穴組的平均潛伏期均較針刺背俞穴組更短，差異有統(tǒng)計學意義。反向試驗結(jié)果提示：SAMP8小鼠存在記憶鞏固和再學習能力的損害，這三種針法均能顯著的改善這種認識功能損害，并顯示穴位特異性，其中，針刺腹穴組顯示更快和更穩(wěn)定的作用。

圖1顯示水迷宮中隱蔽平臺與反向平臺試驗中各組小鼠平均逃避潛伏期的變化趨勢。在隱蔽及反向平臺試驗中，代表各組小鼠學習成績的逃避潛伏期時間均隨訓練天數(shù)的增加而有明顯縮短的趨勢；SAMP8對照組(同樣針刺非穴組)的逃避潛伏期時間下降緩慢而SAMR1對照組下降明顯。

2.2.3空間探索試驗實驗動物在原平臺象限停留時間見表2第6天數(shù)據(jù)。單因素方差統(tǒng)計顯示F(5,58)=9.194,P<0.01，說明諸組間差異有統(tǒng)計學意義；SAMP8對照組(同樣針刺非穴組)比SAMR1對照組短(P<0.05)，針刺腹背穴組(P<0.01)、針刺腹穴組(P<0.01)、針刺背俞穴組(P<0.05)三個針刺組均比SAMP8對照組和針刺非穴組更長；且針刺腹背穴組(P<0.01)和針刺腹穴組(P<0.01)均比針刺背俞穴組長。在穿越原平臺的次數(shù)上，組間差異有統(tǒng)計學意義(F(5,58)=5.922,P<0.05)；SAMP8對照組(同樣針刺非穴組)比SAMR1對照組穿越原平臺次數(shù)(P<0.05)更少，且差異有統(tǒng)計學意義；而針刺腹背穴組(P<0.01)、針刺腹穴組(P<

圖1　隱蔽、反向及可視平臺試驗中各組小鼠平均逃避潛伏期的趨勢圖

0.01)、針刺背俞穴組(P<0.05)三個針刺組均比SAMP8對照組和針刺非穴組次數(shù)多。實驗結(jié)果提示SAMP8小鼠記憶保持能力方面有損害，三種針刺方法均能顯著地改善這種認知損害，且有穴位特異性。Gallagher M(1993)等[8]確定的探索試驗空間學習能力標準為：如果小鼠在原平臺象限停留時間超過總時間的三分之一和穿越原平臺超過2次，就說明該小鼠學會了平臺的空間定位。以此為標準，與正常SAMR1(在原平臺象限停留時間20.79秒,穿越原平臺2.33次)小鼠相比，SAMP8(13.64秒,1.05次)小鼠存在學習記憶保留能力的損害；而在三個針刺組中，針刺腹穴組小鼠(20.26秒,2.15次)和針刺腹背穴組小鼠(20.48秒,2.05次)已經(jīng)學會了平臺的空間定位，因而能更好地完成任務，而針刺背俞穴組小鼠(17.06秒,1.77次)與SAMP8針刺非穴組(13.79秒,1.20次)沒有效果。

2.2.4可視平臺試驗在空間訓練的第10天最后進行，見表2第10天數(shù)據(jù)。單因素方差分析結(jié)果為F(5,58)=1.71,P>0.05，六組間平均逃避潛伏期時間總體差異無統(tǒng)計學意義；但兩兩比較發(fā)現(xiàn)(表2)，SAMP8對照組、針刺非穴組及針刺背俞穴組均比SAMR1對照組更長，均有顯著性差異，這主要歸因于與同齡SAMR1小鼠比較，8月齡SAMP8小鼠逃避危險水域的動機明顯下降[9]，這是8月齡SAMP8小鼠學習成績較差的一個重要原因；而針刺腹背穴組及針刺腹穴組平均逃避潛伏期時間，介于SAMP8對照組和SAMP1對照組之間，且與SAMP8對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義，和SAMP1對照組比較，差異也是無統(tǒng)計學意義的，說明針刺腹背穴及針刺腹穴兩種方法在一定程度上可增強SAMP8小鼠逃避危險水域的動機，降低平均逃避潛伏期時間，這也是該二種針法改善學習記憶的重要原因之一。對運動速度的單因素分析顯示，六組總體比較F(5,58)=2.58,P<0.05，組間差異有統(tǒng)計學意義；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，SAMR1對照組較SAMP8諸組均更快，且差異有統(tǒng)計學意義，而SAMP8諸組間差異無統(tǒng)計學意義，說明8月齡SAMP8鼠在運動速度、運動能力上比同齡SAMR1鼠要更差，這可能對動物空間學習記憶會產(chǎn)生一定的影響?？梢暺脚_試驗提示：8月齡SAMP8小鼠運動速度、運動能力和逃避危險水域的動機對空間學習記憶有重要的影響。

2.2.5空間搜索策略空間搜索策略分析也能反映小鼠思考、分析和判斷的差別，定性地支持水迷宮參數(shù)的結(jié)論。典型的空間搜索策略是小鼠的逃避潛伏期時間接近當日的平均值。水迷宮中，游泳軌跡被當作小鼠的搜索策略。在第1天，所有組小鼠采用邊緣式和隨機式碰觸平臺，游泳的軌跡要么沿池邊的大圈，或者隨機地橫過某一象限。在第3或第5天，SAMR1組更多地通過直線式，SAMP8對照組通常通過邊緣式和隨機式碰觸平臺，更多針刺組的小鼠通過趨向式和直線式找到平臺，而針刺非穴組更多地采用邊緣式和隨機式；故通過持續(xù)的針灸和水迷宮的訓練，使三個針刺組均能更快地搜索到目標， 搜索策略趨向于SAMR1， 也體現(xiàn)穴位的

表2　各組小鼠在水迷宮中平均逃避潛伏期時間

注：第6天數(shù)據(jù)為在原象限的停留時間，而其他天的數(shù)據(jù)為逃避潛伏期時間。與SAMP8對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與針刺非穴組比較，cP<0.05，dP<0.01；與SAMR1對照組比較，eP<0.05，fP<0.01；與針刺背俞穴組比較，gP<0.05。

相對特異性。在探索試驗中，在SAMR1對照組和三個針刺組的小鼠采用在每一象限的中心來回地尋找平臺，而SAMP8對照組和針刺非穴組小鼠則表現(xiàn)沿池壁游走的搜索平臺。提示三種針刺方法能夠改善SAMP8邊緣模式到隨機模式或到直線模式，因而提高了SAMP8鼠的分析和判斷能力，改善了搜索策略。

3　討論

8月齡SAMP8存在明顯的全面老化現(xiàn)象，但目前尚無針刺對SAMP8老化評分影響的研究，本研究首次顯示基于“益氣調(diào)血，扶本培元”基本治則的腹側(cè)配穴、背俞穴配穴及腹背配穴的三種針刺方法均能明顯降低SAMP8的老化評分，提示三種針法均能改善SAMP8小鼠的老化度，說明有改善衰老認知的功能；但針刺腹穴組與針刺腹背穴組自身前后比較降低有統(tǒng)計學意義，而針刺背俞穴組的降低無統(tǒng)計學意義，提示在改善老化認知功能上，針刺腹穴組和針刺腹背穴組更具療效優(yōu)勢。

當前，尚無“益氣調(diào)血、扶本培元”治則不同針刺取穴方法對SAMP8小鼠認知功能影響的研究報告。Morris水迷宮隱蔽平臺主要反映學習的能力，而反向平臺試驗反映再學習的能力，結(jié)果均說明針灸治療與水迷宮訓練天數(shù)的增加可顯著性地提高小鼠學習成績，說明三種針刺方法均有改善認知障礙的功能，但三種不同針刺干預方法的作用呈現(xiàn)顯著性差異，體現(xiàn)其針法的療效差異；SAMP8小鼠(對照組)學習時間比SAMR1小鼠要長，并且平均逃避潛伏期時間下降緩慢，在多天的學習、記憶的治療訓練中體現(xiàn)其學習與再學習能力差，即是認知功能障礙。在學習能力上，SAMP8小鼠針刺背俞穴治療及訓練呈現(xiàn)學習成績改善最快但不穩(wěn)定特點，而針刺腹穴治療及針刺腹背穴治療訓練的學習成績改善較穩(wěn)定的特點；在再學習方面，SAMP8針刺腹穴方法起效最快，并顯著性地優(yōu)于另二種針法。探索試驗主要反映動物記憶保持能力，結(jié)果提示SAMP8小鼠在記憶保持能力方面也有損害，三種針刺方法均能增加在原平臺象限的停留時間和在穿越原平臺的頻次，均能顯著地改善這種記憶保持能力的認知損害，療效有穴位特異性?？梢暺脚_試驗反映出SAMP8存在運動速度、能力以及逃避水域的動機降低的特點，而實驗不同針刺方法治療作用及成績提高均體現(xiàn)能一定程度增強SAMP8小鼠逃避水域的動機，并在定性體現(xiàn)出逃避動機的搜索策略上相應的改善。本實驗綜合分析特點有：三種針法均有改善SAMP8小鼠衰老的作用，但程度有差異；均能較全面改善SAMP8小鼠認知功能，但改善的方面與程度各具特點。綜合考慮三種不同針法在作用于老化度評分及水迷宮實驗結(jié)果，本實驗支持優(yōu)選原有“益氣調(diào)血、扶本培元”針法。

如果結(jié)合三種不同針法用穴特點分析，可能對三種針法實驗結(jié)果及篩選有一定的啟示作用。(1)背俞穴是臟腑之氣輸注于背腰部的腧穴，背俞穴組方也是基于“從三焦氣化失司論治癡呆”及“益氣調(diào)血，扶本培元”基本治則，配穴組方側(cè)重從背側(cè)調(diào)理上中下三焦的肺脾腎三臟及三臟氣化。而實驗說明背俞穴針刺有一定的改善SAMP8認知功能，但“益氣調(diào)血、扶本培元”針法更具優(yōu)勢，這可能與腹前針法為上中下“三?！毖ㄓ忻芮杏嘘P(guān)，人體“四?！苯y(tǒng)御著臟腑、經(jīng)絡氣血的整體功能，整體調(diào)理全身氣血水津液精的生化及代謝，能更好地體現(xiàn)并實現(xiàn)三焦氣化的功能。(2)“益氣調(diào)血、扶本培元”針法與其配合背俞穴針刺方法之間療效沒有顯著性差異，腹部穴配取背俞穴也未顯示的疊加療效，而在反向平臺試驗中，“益氣調(diào)血、扶本培元”針法起效更快，療效穩(wěn)定，相對有一定的療效優(yōu)勢，且從取穴多寡考慮，取穴少者更有利于“治神”，目前動物實驗的結(jié)果支持優(yōu)選“益氣調(diào)血、扶本培元”針法。

實驗結(jié)論為：三種不同針法都能抵抗SAMP8快速老化進程和降低老化度評分，也均能改善SAMP8認知功能障礙，而改善特點不同；綜合起來，動物實驗支持原有“益氣調(diào)血、扶本培元”針法。

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