大花萱草擴(kuò)繁技術(shù)研究及管理

田野 李毅

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070）

0 前言

1）大花萱草無性繁殖技術(shù)研究狀況

（1）大花萱草簡(jiǎn)介

大花萱草根分為肉質(zhì)根和須根，肉質(zhì)根呈紡錘狀，須根多生長(zhǎng)在肉質(zhì)根上。具短根狀莖，葉翠綠狹長(zhǎng)，基生呈帶狀排成兩列?；ㄌ闹胁砍槌?，螺旋狀聚傘花序，每個(gè)花絮可著花數(shù)十朵?；ɡ偎启ⅲ_如漏斗，裂片翻卷，為百合形花冠，花瓣先端裂開?；ū换亢仙释矤睿廴?枚，3長(zhǎng)3短，花藥呈丁字形背著在花絲頂端，除藍(lán)色和純白色以外其余花色均有栽培品種?；◤阶兓?，花形各異，花期從晚春一直到秋季。大多數(shù)品種的花只開一天，但盛花期可以延續(xù)幾周甚至幾個(gè)月，有些品種單花壽命可超過24小時(shí)。蒴果，黑褐色、多棱形、有光澤，自然結(jié)實(shí)率低，但大部分品種不結(jié)實(shí)。

大花萱草抗旱能力強(qiáng)，耐高溫，抗低寒，適應(yīng)溫度范圍廣，在我國(guó)從南到北均可種植。抗病性強(qiáng)，對(duì)土壤的適應(yīng)性廣，除過酸、過堿、過沙、過粘的土壤外一般都能栽培，PH值以6.5至7.5之間為好。

該類花卉對(duì)堿性土具有特別的耐性，是油田及灘涂地帶不可多得的綠化材料。可用來布置各式花壇、馬路隔離帶、疏林草坡等。亦可利用其矮生特性做地被植物。其中有數(shù)個(gè)品種為“冬青”型，種植在南國(guó)，可四季常綠，是優(yōu)秀的園林綠地花卉。

（2）繁殖方法

分株分割萱草叢塊是最常用的繁殖方法。該方法操作簡(jiǎn)單，植株容易存活，長(zhǎng)勢(shì)比較一致。分株可將母株叢全部挖出，重新分栽；或者是由母株叢一側(cè)挖出一部分植株做種苗，留下的繼續(xù)生長(zhǎng)。

分株多在春季萌芽前或秋季落葉后進(jìn)行。春季分株移栽，當(dāng)年即可抽苔開花；秋季分株移栽，翌年才能抽苔開花。移栽時(shí)應(yīng)選用生長(zhǎng)旺盛、花蕾多、品質(zhì)好、無病蟲害的植株。

分株時(shí)挖取株叢的一部分分蘗作為種苗，挖取部分要帶根，從短縮莖處割開，將老根、朽根和病根剪除，盡量保留肉質(zhì)根，適當(dāng)剪短（約留10厘米）后即可栽植。栽植應(yīng)選在晴天進(jìn)行，邊挖苗，邊分苗，邊栽苗，盡量少傷根，這樣緩苗快。一般2-3年分株一次，以保證植株旺盛的生長(zhǎng)勢(shì)。

組培用幼嫩葉片、花絲和花苔等器官培養(yǎng)成植株。方法是先誘導(dǎo)幼嫩器官產(chǎn)生愈傷組織，然后用適當(dāng)培養(yǎng)基在適宜的溫濕光氣等條件下培養(yǎng)成幼小植株。再將小苗假植于營(yíng)養(yǎng)缽，經(jīng)一段時(shí)間培養(yǎng)成植株幼苗，之后定植。但這種方法還沒有被廣泛接受。

植物的組織培養(yǎng)是利用無性生殖原理，使植物組織在人工控制的條件下，通過細(xì)胞的增殖和分化，快速發(fā)育成新植株的高新技術(shù)手段。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已進(jìn)入生產(chǎn)應(yīng)用階段。利用這種技術(shù)，可以將植物的莖尖、葉片、莖段等切成小片，或用花藥、花粉等在無菌條件下，在玻璃器皿中人工配制的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使它們發(fā)育成完整的植物體。利用植物組織培養(yǎng)的方法，只需要用少量植物材料，就可以在短期內(nèi)誘導(dǎo)出大量“試管苗”。

這種方法不僅繁殖速度快，受季節(jié)影響小，而且誘導(dǎo)變異也比較容易，為科研和生產(chǎn)帶來了很大方便。此外，由于植物的生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞分裂速度快，很少感染病毒。因此，采用莖尖培養(yǎng)還可以有效地脫去病毒，從而獲得更加健壯的植株。植物基因工程技術(shù)的發(fā)展也借助了植物組織培養(yǎng)技術(shù)。培養(yǎng)中的植物組織或細(xì)胞為外源基因的導(dǎo)入提供了便利；轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)驗(yàn)室篩選和大量繁殖也離不開植物的組織培養(yǎng)。由于植物的組織培養(yǎng)技術(shù)科技含量高，繁殖速度快，在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中已獲得廣泛應(yīng)用。

2）研究的目的與意義

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，物質(zhì)文化生活水平的提高，我國(guó)城鄉(xiāng)園林綠化得到了飛速發(fā)展，這對(duì)美化生活、減少環(huán)境污染、改善生態(tài)環(huán)境起到了很大的促進(jìn)作用，但是，我們也應(yīng)該充分認(rèn)識(shí)到目前我國(guó)城市綠地建設(shè)中已存在不少問題，城市園林植物種類較為單一，城市生物多樣性建設(shè)受到影響，特別是地被植物材料嚴(yán)重匱乏，導(dǎo)致了草坪面積發(fā)展過大、用水量過多、養(yǎng)護(hù)費(fèi)用居高不下等問題，影響了城鄉(xiāng)建設(shè)持續(xù)性發(fā)展。各級(jí)政府和組織對(duì)植物的種類和品質(zhì)提出了更高的要求，迫切要求引進(jìn)能部分代替草坪、抗旱節(jié)水、管理費(fèi)用低和觀賞性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)地被植物，以豐富城市園林景觀，豐富生物多樣性，建設(shè)更接近自然的生態(tài)型城市。宿根花卉-大花萱草因其觀賞期長(zhǎng)、觀賞性高、適用性強(qiáng)、種類豐富、群體功能強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)日益受到人們的重視，因而大花萱草的研究和利用面臨著一個(gè)良好的機(jī)遇和發(fā)展前景。

大花萱草(Hemerocallis hybrida)，為百合科萱草屬多年生宿根草本植物。萱草屬植物全世界共約有15～18個(gè)種（中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1980），主要分布于亞洲溫帶至亞熱帶地區(qū)，歐洲有少量分布，其中原產(chǎn)我國(guó)的就約有11種（北京林業(yè)大學(xué)園林系花卉教研組，1988），是世界上萱草屬植物種類最多、分布最廣的國(guó)家。大花萱草主要用途是觀賞，因其具有既可觀花又可觀葉的雙重價(jià)值而廣泛用于切花、盆栽及園林綠化等。萱草花蕾可食用，根可入藥，集觀賞、食用、藥用于一身，是極為可貴的植物資源。

3）植物細(xì)胞全能性的表達(dá)

早在20世紀(jì)初，德國(guó)著名植物學(xué)家Haberlandt根據(jù)細(xì)胞學(xué)的理論就曾預(yù)言，植物細(xì)胞具有全能性（Totipotency）。也就是說每個(gè)體細(xì)胞像胚胎細(xì)胞一樣，可以經(jīng)過體外培養(yǎng)成為一個(gè)完整的植株，這是因?yàn)橹参矬w的每個(gè)細(xì)胞都含有該個(gè)體的全部遺傳信息，都具有一套完整的基因組，因而具有在適宜條件下可以被誘導(dǎo)分化形成完整植株的潛在能力。直至20世紀(jì)50年代末科學(xué)家在胡蘿卜組織單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)榕c合子胚相似的結(jié)構(gòu)，其發(fā)育過程也與合子胚類似，但由于它是從體細(xì)胞分化而來的因而稱之為體細(xì)胞胚，并由此形成了再生植株，直到開花結(jié)實(shí)。這一重大突破不僅證實(shí)了植物細(xì)胞的全能性，而且為細(xì)胞離體培養(yǎng)中研究形態(tài)發(fā)生機(jī)制開拓了一個(gè)新的領(lǐng)域。近20余年，植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)得到了迅速發(fā)展，大量植物無論是二倍體細(xì)胞或單倍體性細(xì)胞以及原生質(zhì)體離體培養(yǎng)均可獲得再生植株。大量事實(shí)證明，植物體成熟組織中已高度分化的細(xì)胞液保留了回復(fù)到分生組織狀態(tài)的能力[6]。當(dāng)然，細(xì)胞能夠經(jīng)歷這一回復(fù)過程的程度是不同的，這主要取決于細(xì)胞所達(dá)到的發(fā)育上的、生理上的和細(xì)胞上的狀態(tài)。

4）形態(tài)發(fā)生

所謂形態(tài)發(fā)生就是生物個(gè)體發(fā)育或再生過程中，機(jī)體及其器官形態(tài)結(jié)構(gòu)的形成過程。在生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)成為一門學(xué)科，而且深入到組織和細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生問題。它不用于形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和胚胎學(xué)，而是在應(yīng)用這些學(xué)科知識(shí)的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物化學(xué)、生理物理學(xué)和遺傳學(xué)的知識(shí)和技術(shù)、專門研究形態(tài)發(fā)生中有關(guān)分化、對(duì)稱、極性和相關(guān)性等現(xiàn)象的外界條件因子、內(nèi)在生理化學(xué)及遺傳基礎(chǔ)，從而了解其機(jī)制，已達(dá)到控制目的的一門學(xué)科。植物組織或細(xì)胞離體培養(yǎng)中的形態(tài)發(fā)生有器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生這倆種途徑形成再生植株。這兩種形態(tài)發(fā)生途徑都是以細(xì)胞分化為基礎(chǔ)的，它包含了組織和器官的形成。已分化的細(xì)胞各自組成了不同的組織，一般形態(tài)和技能相同的細(xì)胞組成同一種組織，然后再由機(jī)能相關(guān)的組織形成器官。形態(tài)發(fā)生的最后結(jié)果是形成以個(gè)發(fā)育成熟的發(fā)育植株。

1 材料與方法

1.1 材料:供試大花萱草植株

1.1.1 試劑

乙醇。

吲哚乙酸（IAA）或 2，4-D（生長(zhǎng)素類似物）。

氯化汞（升汞）或次氯酸鈉。

6-芐基氨基腺嘌呤（6-BA）

MS培養(yǎng)基

0.1 mol/L NaOH與0.1mol/L HCl

1.1.2 儀器設(shè)備

培養(yǎng)室，高壓滅菌鍋，水浴鍋，解剖刀，三角燒瓶（100mL），燒杯，量筒，培養(yǎng)皿，棉線，接種箱或超凈工作臺(tái)，分析天平，長(zhǎng)鑷子，剪刀，容量瓶，移液管，牛皮紙。

1.2 分株繁殖

分株苗床，寬1-2m，長(zhǎng)2-3m，每隔20cm，挖一深約6cm穴。將分蘗苗移植其中，之后覆土，分株苗處理。在萌芽前，將株叢從盆中挖出，去掉傷根、病根，盡量保留肉質(zhì)根。栽植應(yīng)選擇晴天進(jìn)行，邊挖邊分栽，盡量少傷根，一般2-3年分株一次，以保證植株旺盛生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)以10盆為一組，先設(shè)計(jì)重復(fù)。

1.3 組織培養(yǎng)擴(kuò)大繁殖

植物組織培養(yǎng)的簡(jiǎn)單過程如下:剪接植物器官或組織——經(jīng)過脫分化（也叫去分化）形成愈傷組織——再經(jīng)過再分化形成組織或器官——經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)育成一顆完整的植株。

植物組織培養(yǎng)的大致過程是:在無菌條件下，將植物器官或組織（如芽、莖尖、根尖或花藥）的一部分切下來，放在適當(dāng)?shù)娜斯づ囵B(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，這些器官或組織就會(huì)進(jìn)行細(xì)胞分裂，形成新的組織。不過這種組織沒有發(fā)生分化，只是一團(tuán)薄壁細(xì)胞，叫做愈傷組織。再適合的光照、溫度和一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與激素等條件下，愈傷組織便開始分化，產(chǎn)生出植物的各種器官和組織，進(jìn)而發(fā)育成一棵完整的植株。

植物組織培養(yǎng)即植物無菌培養(yǎng)技術(shù)，是根據(jù)植物細(xì)胞具有全能性的理論，利用植物體離體的器官如根、莖、葉、莖尖、花、果實(shí)等）組織（如形成層、表皮、皮層、髓部細(xì)胞、胚乳等）或細(xì)胞（如大孢子、小孢子、體細(xì)胞等）以及原生質(zhì)體,在無菌和適宜的人工培養(yǎng)基及光照、溫度等人工條件下，能誘導(dǎo)出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的學(xué)科。

1.3.1 配制培養(yǎng)基

配制MS培養(yǎng)基母液和NAA、6-BA等激素母液，比例為大量元素100mL/L，微量元素 10mL/L，有機(jī)物 10mL/L，無機(jī)鹽 10mL/L，NAA0.01mL/L，6-BA4mg/L，瓊脂 7.5mg/L，蔗糖 30mg/L，調(diào) pH 值 5.6～5.8，放在三角瓶中，每瓶大致40mL，高壓滅菌鍋中滅菌，備用。

表1 配置MS培養(yǎng)基所需試驗(yàn)材料及配置方法

培養(yǎng)基分類:

（1）愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基（蔗糖含量為 10g/L，2，4-D含量為 2mg/L，瓊脂10g/L）。

（2）試驗(yàn)培養(yǎng)基:在 MS培養(yǎng)基中加入 IAA和 6-BA。

吲哚乙酸（IAA)先用少量0.1 mol/L NaOH溶解，6-芐基氨基腺嘌呤先用少量0.1 mol/L HCl溶解，然后用蒸餾水稀釋，再加入培養(yǎng)基中。

1.3.2 取材與消毒

取實(shí)驗(yàn)材料，用流水沖洗4-5次，用刀將莖外部切掉，并將莖切成小段，取每一段上帶有1-2個(gè)芽點(diǎn)植株為外植體，再用蒸餾水沖洗，然后放到超凈工作臺(tái)上表面滅菌，流程為70%酒精20s-50mLNaF10min——無菌水沖洗3-5次，然后接種。

1.3.3 接種培養(yǎng)

將消毒過的萱草外植體在消過毒的濾紙上切成0.5cm大小方塊，接種到培養(yǎng)基上，每瓶接種三個(gè)，接種過程中，所用器具應(yīng)用75%酒精棉擦拭，酒精燈火焰上消毒。避免工具帶菌，造成交叉感染，接種后將培養(yǎng)瓶移入培養(yǎng)箱上培養(yǎng)，溫度控制在22度左右，每天光照12-16h，光照強(qiáng)度1000-2000lx，一般培養(yǎng)1-7d后，莖段邊緣突起分化成芽。待10d后，繼代培養(yǎng)。

1.3.4 初代培養(yǎng)

初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某些外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)時(shí)，常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少量的生長(zhǎng)素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括:莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。

采用外源的細(xì)胞分裂素，可促進(jìn)使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動(dòng)生長(zhǎng)，從而形成一個(gè)微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。在幾個(gè)月內(nèi)可以將這種叢生苗的一個(gè)枝條轉(zhuǎn)接繼代，重復(fù)芽苗增殖的培養(yǎng)，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，就能得到可種植到土壤中去的完整小植株。

在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細(xì)胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性（這與胚狀體不同）。多數(shù)情況下它形成芽，后形成根。

1.3.5 繼代培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)上，將初代培養(yǎng)的芽叢分割，同時(shí)用解剖刀將植株底部褐化部分、新葉切除，以減少由于葉片生長(zhǎng)而引起營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗，對(duì)芽分化的抑制從而促進(jìn)芽的分化，達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐瑫r(shí)統(tǒng)計(jì)每瓶中外植體分化芽的數(shù)目。實(shí)驗(yàn)以10瓶為一組，共計(jì)10個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分株發(fā)芽率和組織培養(yǎng)繁殖率

2.1.1 每一母株分化芽數(shù)量統(tǒng)計(jì)表

表2

2.1.2 組織培養(yǎng)數(shù)量統(tǒng)計(jì)表

表3

2.1.3 分株發(fā)芽率和組織培養(yǎng)繁殖率比較

分株繁殖一輪發(fā)芽率75.3%，繁殖率較高，組培三周左右繁殖率達(dá)5.33%。比較得知，組培較分株繁殖率高，而且時(shí)間短，可達(dá)到短期繁殖目的。

2.2 各因素對(duì)大花萱草擴(kuò)繁的影響

在本實(shí)驗(yàn)中，曾出現(xiàn)污染現(xiàn)象，原因可能是:

2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器消毒未凈

2.2.2 解剖刀鈍，殺死組織或引起葉片卷曲

2.2.3 葉片生長(zhǎng)接觸三角瓶蓋，引起植株感染

2.2.4 對(duì)外植體消毒時(shí)，未將組織病毒全部殺死

2.2.5 每次操作后對(duì)儀器滅菌不干凈引起交叉感染

圖1 組織培養(yǎng)Figure 1 Tissue culture

3 討論

通過分析，規(guī)范操作技術(shù)，最終達(dá)到無污染，快速繁殖的結(jié)果，形成一整套快繁技術(shù)。

在結(jié)果中，認(rèn)為分株和組培均可達(dá)到繁殖要求，但組培要求過高，實(shí)驗(yàn)儀器精密，需要專業(yè)人員操作，而且耗費(fèi)太大。對(duì)于一些稀有品種或結(jié)實(shí)率不高的品種，可以采用組培達(dá)到目的，以保存物種；對(duì)于普通品種，分株即可達(dá)到擴(kuò)繁目的。

通過實(shí)驗(yàn)，了解并掌握了如何快速準(zhǔn)確的查找資料，提高了分析問題，解決問題的能力。經(jīng)過對(duì)最初實(shí)驗(yàn)失敗原因總結(jié)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)驗(yàn)過程有了全面的認(rèn)識(shí)，為以后實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行打下良好的基礎(chǔ)。但由于掌握的知識(shí)有限，雖在實(shí)驗(yàn)的過程中不斷發(fā)掘明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮头椒?，但試?yàn)仍有一些不足之處，希望在今后的實(shí)驗(yàn)中完善。

本實(shí)驗(yàn)中大花萱草培養(yǎng)的器官分化途徑有三種情況:一是，在愈傷組織表面形成芽；二是，在愈傷組織內(nèi)部形成根；三是，在同一塊愈傷組織的內(nèi)外分別形成根和芽。一般來說，先形成芽的經(jīng)再培養(yǎng)較易形成根，種植容易成活；而先產(chǎn)生根的在培養(yǎng)45d后仍未見形成芽，至于繼續(xù)培養(yǎng)下去能否在其上方分化出芽，還需要做進(jìn)一步深索。

4 結(jié)語(yǔ)

通過組培可使大花萱草得到擴(kuò)繁，快繁無病毒不變異苗木。在實(shí)驗(yàn)過程中一定要注意充分消毒，防止感染。組培中容易發(fā)生褐化、玻璃化現(xiàn)象。在操作時(shí)盡量采用不易變異的外植體擴(kuò)繁，以縮短繼代時(shí)間。限制繼代次數(shù)。每隔一定繼代次數(shù)后重新開始。切取外植體材料時(shí)，采取適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)種類和較低濃度，或少或不使用培養(yǎng)基中易引起變異的化學(xué)物質(zhì)。定期配制，及時(shí)處理，跟蹤檢測(cè)，最終形成一套擴(kuò)繁方法，指導(dǎo)大花萱草在北方地區(qū)引種生產(chǎn)及應(yīng)用，從而使其在園林中更有用。

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