人參皂苷CK的研究進(jìn)展

于雷 李成龍， 于珊珊

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林省人參科學(xué)研究院，長(zhǎng)春 130117）

人參是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，在中藥中具有重要的地位，其化學(xué)成分復(fù)雜，藥理活性獨(dú)特，具有“百草之王”的美稱，古代多用于久病初愈大補(bǔ)元?dú)夂妥萄a(bǔ)養(yǎng)生之用。2011年，人參食品正式上市，人參終于實(shí)現(xiàn)“藥食同源”［1]。隨著現(xiàn)代分離分析技術(shù)的發(fā)展，人們了解到人參皂苷是人參發(fā)揮藥理作用的主要成分。人參皂苷是由糖和苷元組成的糖苷類化合物，屬于三萜化合物。依照皂苷元的結(jié)構(gòu)可分為3類：一類是齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷，皂苷元為齊墩果酸；另兩類是達(dá)瑪烷型的四環(huán)三萜皂苷，它們?cè)谌藚⒃碥罩姓即蠖鄶?shù)，是人參的主要活性成分之一。依據(jù)苷元的不同，可將達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷分為原人參二醇系皂苷，如人參皂苷Rb1（GRb1）、GRd和GRh2等，原人參三醇系皂苷，如人參皂苷Re（ GRe ）、GRg1和GRg2等［2，3]。到目前為止，分離出人參皂苷單體40余種，其中主要含有人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rg1和Re，占人參皂苷總量的80%以上［4]，其余皂苷只占皂苷總量的一小部分，被稱為稀有人參皂苷。雖然這些皂苷含量很少，但具有獨(dú)特的藥理活性。其中，稀有人參皂苷CK-原人參二醇型皂苷具有高效的抗皮膚老化，抗癌，抗炎，保護(hù)心肌的諸多功效，近些年來(lái)倍受人們關(guān)注。

人參皂苷CK在天然人參中并不存在，據(jù)早期文獻(xiàn)報(bào)道，人參皂苷CK是由人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化而來(lái)，轉(zhuǎn)化過(guò)程是腸道細(xì)菌作用的結(jié)果［5]。隨后的一些試驗(yàn)闡明人參皂苷Rb1經(jīng)腸道微生物轉(zhuǎn)化成稀有人參皂苷CK的代謝途徑［6，7]。2011年，Wang 等［8]給6個(gè)健康人同時(shí)服用10 g人參根粉末，分別在0、2、4、7、9和12 h后檢測(cè)人體血漿發(fā)現(xiàn)，在不同時(shí)間點(diǎn)，人參皂苷Rb1、Rd、Rg2和CK相繼出現(xiàn)，且人參皂苷Rb1量逐漸減少而CK量逐漸增加。此試驗(yàn)再一次驗(yàn)證了CK是由Rb1經(jīng)腸道微生物轉(zhuǎn)化而來(lái)。人參皂苷CK作為發(fā)揮藥理作用的最終形式引起了研究人員的廣泛關(guān)注，進(jìn)而對(duì)其藥理活性進(jìn)行了大量的研究。

1 人參皂苷CK的藥理活性研究

1.1 抑制記憶T細(xì)胞

記憶T細(xì)胞在人體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)外來(lái)入侵者進(jìn)入人體時(shí)，記憶T細(xì)胞會(huì)對(duì)其產(chǎn)生記憶，當(dāng)其再次入侵時(shí)記憶T細(xì)胞會(huì)對(duì)其進(jìn)行快速反應(yīng)并通知效應(yīng)細(xì)胞將其消滅，保護(hù)人體免受傷害。心臟病早已成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病之一，嚴(yán)重者需要靠心臟移植手術(shù)維持生命。在移植手術(shù)中心臟作為外源物質(zhì)會(huì)受到機(jī)體的排斥，Kang等［9]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷CK在心臟移植手術(shù)中具有抗免疫力的功能，能夠延長(zhǎng)移植心臟的存活時(shí)間，人參皂苷CK在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中能夠顯著抑制CD4+和CD8+記憶T細(xì)胞的增殖。在小鼠體內(nèi)人參皂苷CK能夠聯(lián)合抗-CD154和抗-LFA-1單克隆抗體延長(zhǎng)移植心臟的存活時(shí)間，并沒(méi)有明顯毒副作用。數(shù)據(jù)中還顯示人參皂苷CK能夠減少白細(xì)胞介素-2和干擾素-γ的表達(dá)，而不是增強(qiáng)T細(xì)胞的表達(dá)。此研究對(duì)開(kāi)發(fā)人參皂苷CK的臨床抗免疫藥物具有重要意義。

1.2 抗腫瘤促進(jìn)細(xì)胞凋亡

由于經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成的污染使癌癥患者的數(shù)量逐年增加，因此尋找治療藥物迫在眉睫。Cho等［10]的研究表明，人參皂苷CK能夠抑制人白血病細(xì)胞HL-60的生存，細(xì)胞的死亡具有典型的凋亡特征。caspase-8在人參皂苷CK激發(fā)的細(xì)胞凋亡中起到了關(guān)鍵性作用。Chae等［11]研究表明，人參皂苷CK能夠增強(qiáng)γ射線對(duì)人體內(nèi)肺癌細(xì)胞NCI-H460的放射療效，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。這表明CK具有和γ射線放射療法相結(jié)合治療癌癥的應(yīng)用性。Wang等［12]利用試驗(yàn)比較人參皂苷CK和Rb1對(duì)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞HCT-116 和SW-480的影響，通過(guò)對(duì)它們進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，人參皂苷CK能夠顯著抑制癌細(xì)胞的增殖，細(xì)胞阻滯是發(fā)生在分裂期的G1期并誘導(dǎo)其凋亡。然而母體人參皂苷Rb1并沒(méi)有這些作用。結(jié)果表明人參皂苷CK可能成為有效治療結(jié)腸直腸癌的潛在藥物。Park等［13]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷CK能夠抑制STAT3的磷酸化作用和其上游的活化因子JAK1，還增強(qiáng)了蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1的表達(dá)。結(jié)果表明CK誘導(dǎo)了U266細(xì)胞的凋亡，也表明CK在治療多發(fā)性骨髓瘤上具有的化學(xué)預(yù)防潛力。Hu等［14]利用人胃癌細(xì)胞系BGC823、SGC7901和裸鼠人胃癌移植瘤作為模型研究CK對(duì)胃癌作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯發(fā)生在細(xì)胞分裂期的G2階段，CK通過(guò)線粒體介導(dǎo)內(nèi)部途徑誘導(dǎo)BGC823和SGC7901凋亡。而在裸鼠中，CK有效抑制SGC7901細(xì)胞形成腫瘤。最終結(jié)果表明人參皂苷CK可以顯著抑制人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其通過(guò)Bid介導(dǎo)途徑凋亡。

1.3 抗炎

Joh等［15]給因服用三硝基苯磺酸而引發(fā)結(jié)腸炎的小鼠口服人參皂苷CK。結(jié)果顯示，人參皂苷CK可以抑制結(jié)腸髓過(guò)氧化酶達(dá)到88%。人參皂苷CK可以通過(guò)抑制促炎因子IL-1β、TNF-a和IL-6的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子的IL-10的活性從而達(dá)到抗炎的目的。Park等［16]使用因全身感染和大腦缺血而產(chǎn)生的大腦疾病的小鼠模型觀察人參皂苷CK對(duì)其影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷CK減少了iba1陽(yáng)性激活小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，并抑制了α-因子和β-白細(xì)胞介素的表達(dá)，減少了缺血大腦中梗塞的體積，說(shuō)明人身皂苷CK是很好的抗神經(jīng)炎疾病的藥物。Shin等［17]研究了人參皂苷CK對(duì)因使用惡唑酮造成小鼠耳部炎癥的作用后發(fā)現(xiàn)，在利用濃度為0.02%和0.05%的人參皂苷CK處理16 d后，小鼠耳部腫脹程度縮減了54%和76%。研究認(rèn)為人參皂苷CK通過(guò)對(duì)巨噬細(xì)胞分泌的COX-2和Th細(xì)胞誘導(dǎo)的干擾素-γ和IL-4的調(diào)控，可以有效治療接觸性皮炎。

1.4 抗皮膚衰老

He等［18]對(duì)纖維母細(xì)胞分組培養(yǎng)，其中一組含有人參皂苷CK；另一組為對(duì)照組，培養(yǎng)2 h。隨后利用紫外線進(jìn)行分組試驗(yàn)，一組接受紫外線輻射，紫外線強(qiáng)度分別為50、100、200 KJ/m2。另一組不進(jìn)行紫外輻射。試驗(yàn)結(jié)果表明，金屬機(jī)制蛋白酶活性和蛋白質(zhì)水平通過(guò)紫外照射后有所增強(qiáng)，但經(jīng)過(guò)CK處理過(guò)的被抑制。用CK提高了膠原蛋白的表達(dá)，抑制了紫外對(duì)纖維母細(xì)胞的輻射。CK是潛在的預(yù)防與治療皮膚衰老的藥物。

1.5 保護(hù)心肌

Tsutsumi等［19]對(duì)試驗(yàn)小鼠進(jìn)行心臟缺血再灌注試驗(yàn)，并對(duì)離體心臟進(jìn)行生化分析。在研究后發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)缺血再灌注后，與對(duì)照組相比，人參皂苷CK可以減少心臟梗塞面積。結(jié)果表明利用CK處理心臟可以減少Ca2+誘導(dǎo)引起的線粒體膨脹。此項(xiàng)試驗(yàn)首次在小鼠上證明了CK對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用并揭示了其機(jī)制。

1.6 人參皂苷CK亞慢性毒性研究

Gao等［20]通過(guò)給雄性和雌性狗注射人參皂苷CK來(lái)研究CK是否有毒性。注射劑量分別為6.7、20和60 mg/kg/day，隨后觀察90 d體重、進(jìn)食量、血液、體溫、心電圖、尿檢、尸檢、器官重量和組織病理學(xué)檢查等多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示體重、進(jìn)食量、血液、體溫、心電和尿檢等指標(biāo)均未受到CK的影響，但對(duì)多指標(biāo)觀測(cè)分析肝毒性時(shí)，肝中毒明顯，但作者認(rèn)為這種現(xiàn)象有可能是可逆的。

2 人參皂苷CK的制備

人參皂苷突出的藥理活性引起了廣泛的關(guān)注，尋找一條有效的獲得途徑成為迫切需求。世界上很多學(xué)者致力于CK的生產(chǎn)研究。人參皂苷CK屬于原人參二醇型皂苷，此類皂苷結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是具有相同的母核，不同點(diǎn)是在C-3和C-20位是由不同糖基構(gòu)成。傳統(tǒng)思維是通過(guò)利用酸堿水解的方法獲得產(chǎn)物，但化學(xué)方法存在污染大，耗資大，水解副產(chǎn)物多等弊端。由于研究已證實(shí)，人參皂苷CK在天然人參中并不存在，它是由人體腸道細(xì)菌作用后得到的。這為人參皂苷CK的制備開(kāi)辟了一條新的途徑。目前用于生產(chǎn)人參皂苷CK的研究多數(shù)集中于生物轉(zhuǎn)化，主要包括微生物轉(zhuǎn)化和酶轉(zhuǎn)化。

2.1 微生物轉(zhuǎn)化的研究

土壤是微生物生長(zhǎng)的主要聚集地，用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人參皂苷CK的微生物主要來(lái)源于土壤。Wang等［21]從土壤中篩選出菌株Sphingomonassp. ZY-3，該菌株可以將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化成人參皂苷CK，通過(guò)試驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行闡述， 過(guò)程為Rb1→Rd→F2→CK，但并未對(duì)該菌株對(duì)人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行研究。Zhou等［22]利用菌株P(guān)aecilomyces bainiersp. 229對(duì)三七葉總皂苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究，結(jié)果顯示有人參皂苷CK的生成，并對(duì)影響轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行了研究，獲得了菌株轉(zhuǎn)化人參皂苷CK的最佳條件，CK的最高轉(zhuǎn)化率高達(dá)82.6%。楊元超等從土壤中篩選出的鐮刀屬真菌串珠鐮孢Fusarium moniliforme可以將人參中含量較高的人參皂苷Rb1和Rd等轉(zhuǎn)化成人參皂苷CK，且轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示人參皂苷Rb1可以被完全轉(zhuǎn)化。崔宇等［24]從土壤中篩選出了一種鐮刀霉屬Fusarium，真菌利用人參果總皂苷為底物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人參皂苷CK，轉(zhuǎn)化前后人參皂苷CK的量相差了40倍之多。研究人員也對(duì)影響轉(zhuǎn)化的條件和菌株進(jìn)行了試驗(yàn)。侯耀達(dá)等［25]利用霉菌GS1- 33轉(zhuǎn)化人參總皂苷生產(chǎn)人參皂苷CK，在以水為培養(yǎng)基，pH3.0時(shí)，人參皂苷CK的產(chǎn)率可達(dá)到14%。Chi等［26]利用食品微生物Bifidobacteriumsp. Int57，Bif. sp. SJ32、Aspergillus niger和A. usamii將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化成了人參皂苷CK、Rd和F2。

2.2 酶轉(zhuǎn)化的研究

酶轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點(diǎn)在于專一性強(qiáng)，時(shí)間短，過(guò)程簡(jiǎn)單，產(chǎn)物易于分離。國(guó)內(nèi)外學(xué)者都進(jìn)行了相當(dāng)多的研究，國(guó)內(nèi)學(xué)者多利用β-葡聚糖苷酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得人參皂苷CK并取得了一定的成果。姜彬慧等［27]利用4種工業(yè)制劑酶對(duì)三七葉總皂苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得人參皂苷CK，并篩選出最佳酶制劑，其中β-葡聚糖苷酶對(duì)三七葉總皂苷轉(zhuǎn)化作用最強(qiáng)。Yan等［28]利用菌株P(guān)aecilomyces bainiersp. 229發(fā)酵獲得的β-葡聚糖苷酶能夠?qū)⑷藚⒃碥誖b1轉(zhuǎn)化成人參皂苷CK，并研究了其主要代謝途徑為Rb1→ Rd→F2→CK，通過(guò)試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了另一種代謝途徑為Rb1→ gypenoside XVII→F2→CK。Noh等［29]利用菌株Sulfolobus solfataricus發(fā)酵獲得對(duì)熱穩(wěn)定的β-葡聚糖酶分別對(duì)Rb1、Rb2、Rd和Rc進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得CK，分析認(rèn)為其代謝途徑為Rb1或Rb2→Rd→F2→CK和Rc→Mc→CK。李翠翠等［30]從真菌Aspergillussp.g848p發(fā)酵產(chǎn)生人參皂苷糖苷酶，能同時(shí)轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1、Rb2和Rc生成人參皂苷CK，該酶最適溫度為45℃，最適pH為5.0，轉(zhuǎn)化時(shí)間為24 h。Noh等［31]從嗜酸熱硫化葉菌中Sulfolobus acidocaldarius分離出的β-葡聚糖苷酶可以將人參皂苷Rb1、Rb2和人參皂苷Rd轉(zhuǎn)化成稀有人參皂苷CK，對(duì)3種皂苷的轉(zhuǎn)化效率從高到低依次為Rb1>Rd>Rb2，并確定了其轉(zhuǎn)化途徑是Rb1→Rd→CK和Rb2→compound Y→CK。

2.3 重組酶轉(zhuǎn)化的研究

盡管酶法轉(zhuǎn)化具有一定優(yōu)勢(shì)，但從微生物發(fā)酵中分離轉(zhuǎn)化的酶，過(guò)程工序繁多，耗時(shí)長(zhǎng)，產(chǎn)量低。利用現(xiàn)代酶工程技術(shù)對(duì)酶進(jìn)行重組，獲得高表達(dá)的酶制劑省去很多麻煩。Noh等［32]利用來(lái)源于Sulfolobus solfataricus的熱穩(wěn)定重組β-葡聚糖苷酶將10%（W/V）人參根提取物轉(zhuǎn)化為CK。在溫度為85℃，pH為5.5時(shí)，對(duì)人參根提取物中的Rb1、Rb2、Rd和Rc總轉(zhuǎn)化率為45.7%。Yoo等［33]從火球菌屬菌種Pyrococcus furiosus中找到了表達(dá)β-葡聚糖苷酶的基因并克隆到大腸桿菌中。β-葡聚糖苷酶轉(zhuǎn)化Rd生成CK的轉(zhuǎn)化率高達(dá)82.5%（mol/mol），將10%人參根提取物中的Rb1、Rb2、Rd和Rc轉(zhuǎn)化生成CK，總轉(zhuǎn)化率為79.5%。

3 展望

我國(guó)藥用資源豐富，伴隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，研究工藝迅猛發(fā)展，中醫(yī)藥理論的日漸完善，很多中藥單體的活性已經(jīng)得到國(guó)際公認(rèn)。人參中多種成分都已開(kāi)始得到研究［34-36]，而人參皂苷CK以其突出的藥理活性引起人們廣泛的關(guān)注。例如，抗皮膚衰老、抗血栓、抗炎、保護(hù)心肌，特別是在誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，治療癌癥方面具有突出的表現(xiàn)，為治療抗癌藥物的開(kāi)發(fā)提供了新的道路。人參皂苷CK是原人參二醇型皂苷在人體腸道內(nèi)的代謝產(chǎn)物，天然人參中并不存在，尋找一條有效的生產(chǎn)途徑尤為重要。目前用于制造CK的方法分為化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)方法存在產(chǎn)物難以控制，難以獲得單一性的目標(biāo)產(chǎn)物，后續(xù)還要大量的分離工序，對(duì)環(huán)境污染比較嚴(yán)重等缺點(diǎn)。因此，相關(guān)研究逐年減少，現(xiàn)在多集中于生物轉(zhuǎn)化法上。生物轉(zhuǎn)化法對(duì)設(shè)備要求不高，反應(yīng)溫和，關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)在于生物轉(zhuǎn)化法的產(chǎn)率高，產(chǎn)物比較單一，省去了大量的分離工作?，F(xiàn)在重組酶已經(jīng)用于轉(zhuǎn)化酶的生產(chǎn)當(dāng)中，利用現(xiàn)代生物技術(shù)，獲得大量的轉(zhuǎn)化酶。相信人類在稀有人參皂苷CK生產(chǎn)方面必定取得突破，能夠促進(jìn)人參資源的有效利用，使其在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域大放異彩。

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