蛋白激酶CK2β亞基在肝癌中上調(diào)表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

張 薇，張?jiān)?，?灝，余 龍

（復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳學(xué)研究所，上海 200433）

肝癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率已超過100萬／年，我國(guó)一直是世界范圍內(nèi)肝癌高發(fā)區(qū)，我國(guó)的肝癌死亡率位于癌癥死亡率的第二位.發(fā)病率約為歐美國(guó)家的10倍［1］.肝癌因其惡性程度高，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，病情進(jìn)展快，以及缺乏有效的早期診斷方法，大部分患者就診時(shí)已為晚期.肝癌是先天耐藥的癌癥，細(xì)胞毒化療藥物對(duì)晚期肝癌療效差，治療技術(shù)有限，有效治療尚無標(biāo)準(zhǔn)方案［2］.因此肝癌致病基因以及致病機(jī)理的研究對(duì)于肝癌的病理診斷和針對(duì)肝癌特異靶點(diǎn)的藥物研發(fā)尤為重要.

蛋白激酶CK2最初發(fā)現(xiàn)于1954年，曾經(jīng)被稱為酪蛋白激酶Ⅱ，是一種在真核細(xì)胞中普遍存在的信使非依賴性絲／蘇氨酸蛋白激酶，高度保守且功能多樣［3-6］.在細(xì)胞的生長(zhǎng)，增殖，凋亡以及生物節(jié)律的調(diào)控中均發(fā)揮重要的作用.CK2是一類酶家族，由兩類催化亞基（α和α'）和一類調(diào)節(jié)亞基（β）構(gòu)成.CK2可以以全酶的形式存在，形成異源四聚體（α2β2；α'2β2；αα'β2），各個(gè)亞基也可能以游離的狀態(tài)存在［7］.CK2是一種具有底物水平磷酸化能力的蛋白激酶，有多種底物，這些底物涉及細(xì)胞功能的許多方面，如DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，RNA加工與翻譯，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與加工，癌基因與抑癌基因活性的調(diào)節(jié)等［8，9］.

目前的研究表明CK2不僅對(duì)于細(xì)胞的存活和正常的生理功能的行使必不可少，而且與眾多疾病，特別是腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在迄今為止已檢測(cè)過的腫瘤中，CK2均表達(dá)失調(diào).CK2激酶活性的增高可能與腫瘤細(xì)胞的分化程度及侵襲轉(zhuǎn)移等有關(guān).如Pallares等在研究發(fā)現(xiàn)，在頭頸癌中CK2的激酶活性的增高與腫瘤的分級(jí)分期密切相關(guān)［10］.一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，CK2的表達(dá)失衡導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)致癌潛能被激發(fā).如CK2聯(lián)合C－Myc的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以顯著增加小鼠患淋巴瘤和白血病的幾率.這些研究表明，CK2參與腫瘤的發(fā)生可能與其對(duì)細(xì)胞中其他致癌信號(hào)的調(diào)控有關(guān)［11］.因此CK2已經(jīng)成為一個(gè)有前景的治療靶點(diǎn)，不同作用模式的CK2抑制劑相繼誕生，根據(jù)其作用模式的不同，可以分為ATP競(jìng)爭(zhēng)性和非ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，后者又包括底物靶向抑制劑，CK2α亞基外部靶向抑制劑及阻斷亞基相互作用抑制劑［12］.

CK2的β亞基，是催化亞基α或α'的特異配體，對(duì)全酶活性及穩(wěn)定性起調(diào)節(jié)作用.其N端（5～104AA）組成的α螺旋酸性環(huán)區(qū)通過與α亞基的賴氨酸富含區(qū)相互作用，調(diào)節(jié)CK2的激酶活性，控制其對(duì)底物的磷酸化.與催化亞基具有多種異構(gòu)體不同的是，目前在哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)亞基CK2β只發(fā)現(xiàn)了一種，由215個(gè)氨基酸殘基組成，在種屬間具有高度保守性（如人與果蠅之間可達(dá)88%同源性），這提示CK2β是CK2細(xì)胞功能重要介導(dǎo)劑［12，13］.過去曾認(rèn)為CK2β只存在于全酶中，對(duì)催化亞基起靶向調(diào)節(jié)作用，因此以往的研究多針對(duì)CK2α催化亞基，特別是以其作為抑制CK2激酶活性并作為抗腫瘤藥物的靶點(diǎn)，而往往忽視了調(diào)節(jié)亞基CK2β的功能.然而，現(xiàn)在越來越多的資料表明，CK2β?lián)碛械莫?dú)立于CK2激酶的功能，具有更為重要和廣泛的調(diào)節(jié)作用，它通過與c－Mos，Chk1，A－Raf等激酶直接互作調(diào)節(jié)其激酶活性，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)功能［14-17］.如Martel等人用特異性小肽靶向CK2β，可增加P53蛋白量，通過P53途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［18］.也有文獻(xiàn)顯示，在非小細(xì)胞肺癌中，CK2β的表達(dá)明顯上升，特異性靶向CK2β的siRNA可下調(diào)CK2β的蛋白表達(dá)，提示CK2β亞基可能作為一有效的抗癌藥物篩選的分子靶點(diǎn)［19，20］.此外，小鼠和秀麗隱桿線蟲CK2β缺失是致死型突變［21］，說明其在細(xì)胞生存中起著舉足輕重的作用.

報(bào)道顯示，CK2β在腫瘤中的表達(dá)變化僅在頭頸部腫瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、腎癌等中有報(bào)道［22-25］，其在腫瘤中的功能也缺少深入的研究.本文擬研究CK2β在肝癌中的表達(dá)變化及功能，考察CK2β在肝癌中的表達(dá)變化及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響.此外，還將研究消減CK2β表達(dá)能否提高肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，對(duì)siRNA消減靶向CK2β與現(xiàn)有化療藥物聯(lián)合使用進(jìn)行了初步探討.

1 材料與方法

1.1 材料

91例原發(fā)性肝癌及癌旁組織cDNA樣品來自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院.75例原發(fā)性肝癌與癌旁組織樣品購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司，所有診斷均經(jīng)病理切片證實(shí)，染色強(qiáng)度評(píng)分由病理科醫(yī)生獨(dú)立完成.

1.2 細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染

采用SMMC－7721肝癌細(xì)胞均勻接種，使其16h后達(dá)40%～50%匯合度.將4μL Lipofectamin2000與100μL DMEM混合孵育，siRNA片段與100μL DMEM混合孵育，靜置15min.將已貼壁的細(xì)胞用PBS清洗一遍，更換無血清DMEM培養(yǎng)基，45min后將轉(zhuǎn)染混合物均勻滴加，使得siRNA的終濃度達(dá)到10～20nmol／L.4h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).CK2β的敲減siRNA片段序列為（上海吉瑪生物公司）：SiRNA－1：sense5'－3'CGCUACAUCCUUACCAACCGU，Antisense5'－3'ACGGUUGGUAAGGAU GUAGCG；SiRNA－2：sense5'－3'CUUUGGUUACUGUCCUCUUGU，Antisense5'－3'ACACGAGGACA GUAACCAA；siRNA－Ns：sense5'－3'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，Antisense 5'－3'ACGUGAC ACGUUCUCATAA.

1.3 Real－time PCR

按照TOYOBO公司SYBR Green Supermix試劑盒說明書操作.利用溫度梯度PCR摸索適合CK2β實(shí)時(shí)PCR引物的退火溫度.退火溫度60℃，35個(gè)循環(huán).4復(fù)孔，以β2－MG作為內(nèi)參基因，基因的表達(dá)量用相對(duì)定量的方法進(jìn)行比較.引物序列（上海生物工程公司）CK2β－F：GTCCTGGATTTCCTGGTTC TGTG；CK2β－R：CTGCTCAATCAGGTCACTCTGG.

1.4 Western blot

配置SDS－PAGE分離膠和濃縮膠，用SDS上樣緩沖液充分裂解細(xì)胞，收集裂解液，100℃水浴變性8min.室溫100V電壓下進(jìn)行電泳.卸膠，轉(zhuǎn)移緩沖液平衡凝膠和硝酸纖維素膜20min.4℃濕轉(zhuǎn)法100V 2h，脫脂牛奶室溫封閉1h.封閉緩沖液稀釋一抗，室溫下孵育2h或4℃搖床過夜.將膜浸泡在TBST洗滌緩沖液中，漂洗10min，重復(fù)3遍.封閉緩沖液中稀釋二抗（1∶5000～1∶10000），室溫下?lián)u床孵育1h，洗膜3次.用ECL法進(jìn)行顯色.抗體來源：β－actin單克隆抗體（Sigma公司）；抗人CK2βmonoclonal antibody（Epitomics公司）.

1.5 免疫組化檢測(cè)CK2β在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)

將組織芯片放入全自動(dòng)染色機(jī)中進(jìn)行脫蠟；用純水沖洗3次，1次1min.放入阻斷劑中15min；用PBS緩沖液沖洗3次；一抗放入離心機(jī)中7200r／min離心30s，按照1∶50稀釋度用DAKO抗體稀釋液稀釋；滴加一抗，放入4℃冰箱過夜孵育；室溫放置30～45min；將片子用PBS緩沖液沖洗3次；滴加DAKO公司的EnVisionTM＋／HRP兔工作液，孵育30min；時(shí)間到后用PBS沖洗3次，1次1min；在片子上滴加稀釋后的DAB，顯色5min，到時(shí)后自來水沖洗5min；在片子上滴加哈氏蘇木素（Sigma公司）40s，用自來水沖洗2min；將片子放入全自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行脫水，取出封片.鏡檢拍照.

1.6 MTS法測(cè)定消減細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞種于6孔板中，至40%～50%匯合度時(shí)，按細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染.24h后，消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種于96孔板中（2×103／孔）.每24h，每孔加入10μL MTS／DMEM混合液，繼續(xù)培養(yǎng)3h后顯色，連續(xù)檢測(cè)6d.以沒有任何細(xì)胞的無血清DMEM為對(duì)照.檢測(cè)前搖晃培養(yǎng)板8s，混勻.用BioTek H4酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450nm時(shí)各孔的光吸收值.

本研究結(jié)果顯示，相對(duì)于NIPPV單用，納洛酮聯(lián)用NIPPV能顯著增加PO2水平和降低PCO2水平，增加SaO2水平，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明納洛酮聯(lián)用NIPPV能顯著糾正機(jī)體酸堿平衡，糾正低氧血癥；其次，住院死亡率和再次有創(chuàng)氣管插管率顯著降低，說明納洛酮能顯著降低NIPPV治療失敗率，同時(shí)顯著減少住院時(shí)間，有利于減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。用藥期間未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，患者耐受性好，說明納洛酮聯(lián)用NIPPV安全性較好。

1.7 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

細(xì)胞接種和饑餓：首先在35mm的皿底端做好標(biāo)記，將細(xì)胞分為不同的區(qū)域.將目的細(xì)胞按每孔約1.5×106個(gè)細(xì)胞接種，貼壁后細(xì)胞密度約為100%的匯合度時(shí)，用PBS漂洗細(xì)胞2遍，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng).

細(xì)胞劃痕：細(xì)胞饑餓24h后，用20μL的槍頭在鋪滿細(xì)胞的皿中劃一條痕跡，然后用PBS洗2遍，洗去細(xì)胞碎片.Leica DM RA2顯微鏡鏡檢：取不同時(shí)間點(diǎn)用倒置顯微鏡拍攝細(xì)胞相同位置的遷移情況.

2 結(jié) 果

2.1 CK2β在肝癌組織mRNA水平顯著上調(diào)表達(dá)及其與肝癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)分析

用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)了91對(duì)肝癌和癌旁標(biāo)本中CK2β的mRNA水平.采用△△Ct值法，試驗(yàn)中以β2－MG基因作為內(nèi)參基因，計(jì)算每對(duì)樣本中癌組織的CK2β的mRNA與β2－MG的mRNA的相對(duì)表達(dá)量之比（T／N），對(duì)相對(duì)表達(dá)量取log2值作圖（圖1）.分析時(shí)，顯著性差異的閾值設(shè)定為±1.分析時(shí)，正一為上調(diào)一倍，負(fù)一為下調(diào)50%.在69對(duì)樣品（75.8%）中，CK2β在癌組織中呈現(xiàn)顯著性上調(diào)，在8對(duì)樣本（8.79%）中差異不明顯，20對(duì)樣本（21.98%）中呈現(xiàn)顯著性下調(diào).

圖1 CK2βmRNA水平在肝癌組織中顯著性上調(diào)Fig.1 The high expression of gene CK2βmRNA level in HCC

為了觀察CK2β的表達(dá)變化是否對(duì)臨床診斷和治療具有指導(dǎo)性意義，我們將91對(duì)肝癌樣本中CK2β的mRNA變化數(shù)據(jù)與臨床病理特征進(jìn)行了相關(guān)性分析（表1（見第250頁(yè)））.盡管在AFP（Alphafetoprotein），病理分化程度（Pathological differentiation），腫瘤包膜（Tumor encapsulation），肝硬化結(jié)節(jié)（Hepatic cirrhotic nodule），癌栓（Portal vein tumor thromb）等指標(biāo)中沒有觀察到相關(guān)性，但是發(fā)現(xiàn)CK2β的表達(dá)變化與臨床分期（TNM clinical stage）具有相關(guān)性.卡方檢驗(yàn)得出的P值為0.02.這一結(jié)果表明，CK2β的上調(diào)表達(dá)可能參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展.

表1 CK2βmRNA水平在HCC中的表達(dá)與病理資料相關(guān)性分析Tab.1 The correlation between CK2βmRNA expression and clinical pathological data

2.2 CK2β在肝癌組織中的分布和表達(dá)情況及其與臨床病理資料的相關(guān)性分析

對(duì)75對(duì)肝癌組織和相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，將CK2β的多克隆抗體以1∶50比例稀釋，檢測(cè)結(jié)果如下圖所示（圖2）.隨后對(duì)75對(duì)樣本染色強(qiáng)弱進(jìn)行了分級(jí)，0、＋、＋＋、＋＋＋分別代表染色強(qiáng)度弱、中等、強(qiáng)、較強(qiáng).經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析：在肝癌和癌旁組織中，CK2β在細(xì)胞核與細(xì)胞漿中均有表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度有所不同，CK2β在肝癌組織較之癌旁組織總體表達(dá)強(qiáng)度顯著增高（P＜0.01）（表2）.這提示我們CK2β的表達(dá)強(qiáng)度的增高與肝癌的發(fā)生發(fā)展有顯著性的關(guān)系.

圖2 CK2β在癌及癌旁中免疫組化檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The expression of CK2βby immunefluorescent

表2 75對(duì)肝癌及癌旁DAB染色分級(jí)統(tǒng)計(jì)分析表Tab.2 The analysis result of DAB staining of 75HCC cancer and adjacent cancer tissues

為了觀察CK2β的表達(dá)變化是否對(duì)于臨床診斷和治療具有指導(dǎo)意義，我們將75對(duì)肝癌樣品中CK2β的免疫組化染色強(qiáng)度與臨床病例資料進(jìn)行了相關(guān)性分析（表3）.對(duì)細(xì)胞核內(nèi)的染色強(qiáng)度分析得出：CK2β的表達(dá)與年齡（Age），是否小肝癌（Small hepatocellular carcinoma），病理分化程度具有相關(guān)性.卡方檢驗(yàn)計(jì)算其P值分別為：0.02、0.03、0.01.其中與病理分化程度高度顯著相關(guān).對(duì)細(xì)胞漿內(nèi)的染色強(qiáng)度分析得出：CK2β的表達(dá)與是否結(jié)節(jié)（Hepatic cirrhotic nodule）病理分化程度有相關(guān)性.卡方檢驗(yàn)計(jì)算其P值分別為：0.02、0.04.結(jié)果顯示無論在胞核染色還是胞漿染色中，CK2β的表達(dá)和病理分化程度均呈現(xiàn)顯著相關(guān)性.

表3 CK2β染色強(qiáng)度與病理資料相關(guān)性分析Tab.3 The correlation between CK2βstaining degree and clinical pathological data

2.3 siRNA消減CK2β基因表達(dá)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)

經(jīng)siRNA小片段轉(zhuǎn)染SMMC－7721細(xì)胞后，48h收集蛋白裂解液樣.敲減內(nèi)源CK2β的細(xì)胞裂解樣品經(jīng)檢測(cè)后，在敲減片段作用下雜交條帶強(qiáng)度與對(duì)照組相比，蛋白表達(dá)不同程度的減弱，結(jié)果顯示該抗體能夠準(zhǔn)確識(shí)別該目的基因.因此從蛋白水平證實(shí)了敲減片段的有效性，細(xì)胞中的CK2β蛋白的表達(dá)被有效的抑制（圖3（a））.

為了觀察CK2β基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)的影響，用經(jīng)過有效性驗(yàn)證的CK2β的siRNA小片段轉(zhuǎn)染SMMC－7721細(xì)胞.MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3（b）顯示，經(jīng)過6天的連續(xù)檢測(cè)，敲減掉內(nèi)源的CK2β后，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯減慢.與對(duì)照轉(zhuǎn)染Ns小片段的實(shí)驗(yàn)組和未轉(zhuǎn)任何片段的non實(shí)驗(yàn)組相比，細(xì)胞從第4～5天起，增殖情況出現(xiàn)顯著性差異，生長(zhǎng)減緩（P＜0.01）.

克隆形成實(shí)驗(yàn)（圖3－（c）），將SMMC－7721細(xì)胞接種于6孔板中，貼壁后，至40%～50%匯合度時(shí)，轉(zhuǎn)染CK2β敲減siRNA片段1#2#，每組均種有3復(fù)孔.Control組為未轉(zhuǎn)入任何片段組，Ns組為轉(zhuǎn)入nonsilence片段的對(duì)照組.24h后，消化細(xì)胞，并計(jì)數(shù).于6孔板中每孔種入1000個(gè)細(xì)胞.37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2周，期間每3天更換1次新鮮培養(yǎng)基.2周后結(jié)晶紫染色顯示克隆的形成情況.瞬時(shí)敲減掉CK2β基因的克隆形成的大小和密度明顯減小，克隆個(gè)數(shù)減少.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲CK2β除后能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞中克隆的形成.

圖3 消減CK2β表達(dá)后對(duì)細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effect on cell growth when downregulate the expression of CK2β

2.4 敲減CK2β表達(dá)減弱細(xì)胞株的遷移和侵襲能力

為研究CK2β對(duì)于細(xì)胞株遷移能力的影響，在SMMC－7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA小片段24h后，消化細(xì)胞計(jì)數(shù)并種板，使細(xì)胞達(dá)到100%匯合度.細(xì)胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞，24h后劃痕，分別在0，24，48，72h時(shí)顯微鏡10倍鏡下觀察同一區(qū)域并拍照.如下圖所示：NS為對(duì)照轉(zhuǎn)染non－silence片段組，I1為轉(zhuǎn)染1#敲減小片段實(shí)驗(yàn)組.結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組敲減掉CK2β，在48h后遷移的面積明顯小于對(duì)照組（圖4）.細(xì)胞遷移區(qū)域有顯著性差異，細(xì)胞遷移速度減慢.

2.5 消減CK2β表達(dá)豐度能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性

CK2β在肝癌組織中明顯的上調(diào)表達(dá)，并且能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，因此可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用.那么消減CK2β是否能夠增加肝癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性，是否可能成為某種抗腫瘤藥物或聯(lián)合用藥的潛在藥物靶點(diǎn)？

用臨床上常用的10種抗腫瘤藥，將實(shí)驗(yàn)組分為四組：A轉(zhuǎn)染non－silence片段，不加藥；B轉(zhuǎn)染nonsilence片段，加藥；C轉(zhuǎn)染CK2β消減siRNA片段，加藥；D轉(zhuǎn)染CK2β消減siRNA小片段，不加藥組.48 h后用MTS方法檢測(cè).細(xì)胞相對(duì)存活率用后3組的數(shù)據(jù)除以對(duì)照組A組數(shù)據(jù)的平均數(shù)來計(jì)算.t－test結(jié)果顯示（圖5）：相對(duì)于其他3組對(duì)照組，消減CK2β能夠增強(qiáng)SMMC－7721細(xì)胞對(duì)于喜樹堿，長(zhǎng)春新堿，阿霉素和柔紅霉素的敏感性.

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig.4 The cell erasion trace test result

圖5 10種抗腫瘤藥物作用下細(xì)胞生存率效果圖Fig.5 The cell viability after the treatment of 10different anti－cancer drugs

3 討 論

目前對(duì)于CK2在腫瘤中的作用已有深入的研究.CK2的表達(dá)水平與活性的明顯增高，不僅與腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散能力，癌癥預(yù)后相關(guān)，還反映其病理生理學(xué)特征.

蛋白激酶CK2一直被認(rèn)為是治療腫瘤的一個(gè)具有潛力的分子靶點(diǎn)，目前已知的小分子抑制劑主要包括活性肽，鹵代化合物TBB衍生物，多酚衍生物，以及以吲哚喹啉為基礎(chǔ)的衍生物.其中CK2抑制劑CX4945已進(jìn)入Ⅰ期臨床，開始面向晚期實(shí)體瘤和多發(fā)性骨髓瘤患者.這些靶向CK2激酶的藥物研究主要是設(shè)計(jì)針對(duì)CK2催化亞基的小分子抑制劑［26］.由于長(zhǎng)久以來研究者僅認(rèn)識(shí)到CK2β存在于全酶中對(duì)催化亞基起靶向調(diào)節(jié)作用的功能，忽視了其獨(dú)立于該復(fù)合物的功能，因而CK2β的研究一直比較粗淺，特別是缺少其在腫瘤中的功能性研究.近年來現(xiàn)在越來越多的研究開始關(guān)注CK2β獨(dú)立于CK2激酶的功能，揭示了其更為重要和廣泛的調(diào)節(jié)作用，它通過與c－Mos、Chk1、A－Raf等激酶直接互作調(diào)節(jié)其激酶活性，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)功能［7-10］.

對(duì)于CK2β在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也逐漸引起研究者的重視.在血液系統(tǒng)腫瘤中：具有正常核型的急性髓細(xì)胞樣白血病患者中，CK2抑制劑的敏感性與CK2β基因的表達(dá)水平密切負(fù)相關(guān)；慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的存活方面，抑制CK2β基因表達(dá)影響白血病細(xì)胞的存活率.在實(shí)體腫瘤中：Laramas等人的研究顯示，男性前列腺癌中，針對(duì)CK2β的小干擾RNA能夠特異性抑制前列腺細(xì)胞而對(duì)良性細(xì)胞沒有作用.女性子宮內(nèi)膜癌中CK2β的表達(dá)率和強(qiáng)度都明顯升高，利用短發(fā)夾RNA（shRNA）下調(diào)CK2β，癌細(xì)胞的集落形成受阻.在宮頸癌，乳腺癌，頭頸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，胃癌，非小細(xì)胞肺癌，結(jié)直腸癌中通過抑制CK2β的表達(dá)，都不同程度抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［27，28］，發(fā)揮重要功能.

CK2β在肝癌中的表達(dá)變化和功能研究尚屬空白.本研究首先91對(duì)肝癌樣本的CK2β的mRNA水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CK2β較癌旁組織顯著性上調(diào)表達(dá).對(duì)75對(duì)組織標(biāo)本的免疫組化檢測(cè)結(jié)果同樣顯示，較癌旁組織，CK2β蛋白水平表達(dá)明顯上升，分析顯示有顯著性差異（P＜0.01），胞漿和胞核中均顯著性上調(diào)表達(dá).這提示：CK2β可能在肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中行使一定的功能.

隨后合成了針對(duì)CK2β的敲減小片段，從mRNA水平和蛋白水平驗(yàn)證了其具有明顯的消減效果.瞬時(shí)消減SMMC－7721細(xì)胞內(nèi)源的CK2β蛋白，經(jīng)過MTS檢測(cè)，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率顯著性減慢.克隆形成的實(shí)驗(yàn)也相互佐證了該結(jié)果，在敲減掉CK2β的細(xì)胞株中，克隆形成的大小和個(gè)數(shù)有顯著性差異，細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆形成減慢.在劃痕實(shí)驗(yàn)中，瞬時(shí)消減SMMC－7721細(xì)胞內(nèi)源的CK2β蛋白表達(dá)，48h及72h后開始可以觀察到顯著性差異，細(xì)胞遷移的速度減慢.這些都提示：CK2β與肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力有關(guān).這些結(jié)果表明，CK2β在肝癌中顯著上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)量與臨床分期呈正相關(guān)，提示其可能作為輔助肝癌診斷的分子marker.瞬時(shí)消減細(xì)胞內(nèi)源的CK2β表達(dá)可以有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，提示CK2β是肝癌細(xì)胞快速增殖和遷移所必需的.將進(jìn)一步在裸鼠成瘤動(dòng)物模型上進(jìn)一步驗(yàn)證其在體內(nèi)對(duì)瘤體生長(zhǎng)的影響.

本研究還就CK2β在肝癌中能否影響抗腫瘤藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的敏感性做了初步的探討.發(fā)現(xiàn)CK2β的下調(diào)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素，柔紅霉素，喜樹堿，長(zhǎng)春新堿的敏感性.因喜樹堿等藥物通過參與DNA的損傷來發(fā)揮抑制腫瘤作用，而CK2β亦影響DNA的損傷與修復(fù).因此猜測(cè)可能發(fā)揮協(xié)同的效應(yīng).但分子機(jī)制有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明.長(zhǎng)期以來，由于肝癌的治療沒有很有效的治療藥物，采用手術(shù)的切除率還不到15%，抗肝癌治療至今處于技術(shù)有限，有效藥物很少的困難境地.諾拉曲特（Nolatrexed）是目前唯一針對(duì)肝癌的處于三期臨床研究階段的化合物.因此開發(fā)有效的化療藥物應(yīng)用于肝癌的治療非常必要.由于傳統(tǒng)的化療藥物如阿霉素，5－FU反應(yīng)率低，選擇性差，毒副作用較大，而用紫杉醇，氟達(dá)拉賓等藥物進(jìn)行全身化療時(shí)的反應(yīng)率幾乎為零［1］.因此尋找肝癌特異性的治療靶點(diǎn)成為當(dāng)前肝癌化療藥物開發(fā)的熱點(diǎn)和難點(diǎn).本研究不僅提示了CK2β作為新的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)的可能，并且為通過聯(lián)合用藥提高現(xiàn)有抗腫瘤藥物藥效的腫瘤治療思路提供了新的線索.

［1］田學(xué)祿.肝癌治療藥物的研究新進(jìn)展［J］.中國(guó)藥業(yè)，2009，18（24）：64－66.

［2］胡瓊瑩，蔣建東.新的抗肝癌分子靶及相關(guān)藥物研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2005，2（1）：2－5.

［3］Pallares J，Llober D.CK2βIs expressed in endometrial carcinoma and Has a role in apoptosis resistance and cell proliferation［J］.Am J Pathol，2009，174（1）：287－296.

［4］Yde C W，Olsen B B，Meek D，et al.The regulatory beta－subunit of protein kinase CK2regulates cell－cycle progression at the onset of mitosis［J］.Oncogene，2008，27（37）：4986－4997.

［5］Pinna L A.Protein kinase CK2：a challenge to canons［J］.J Cell Sci，2002，115（20）：3873－3878.

［6］Litchfield D W.Protein kinase CK2：structure，regulation and role in cellular decisions of life and death［J］.Biochem J，2003，369（1）：1－15.

［7］Volodina luL，Shtil A A.Casein kinase 2，the versatile regulator of cell survival［J］.Mol Biol，2012，46（3）：423－433.

［8］Gietz R D，Graham K C，Litchfield D W.Interactions between the subunits of casein kinase II［J］.J Biol Chem，1995，270（22）：13017－13021.

［9］劉振杰，劉新光，梁念慈.蛋白激酶CK2在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，22（11）：1281－1285.

［10］梁景耀，劉新光.蛋白激酶CK2與腫瘤發(fā)生［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：生理病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，2004，24（3）：277－279.

［11］魏小華.蛋白激酶CK2在腫瘤生物學(xué)中的作用［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2011，17（1）：75－77.

［12］Kikkawa U，Mann S K，F(xiàn)irtel R A，et al.Molecular cloning of casein kinase II alpha subunit from Dictyostelium discoideum and its expression in the life cycle［J］.Mol Cell Biol，1992；12（12）：5711－5723.

［13］Glover C V.On the physiological role of casein kinase II in Saccharomyces cerevisiae［J］.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，1998，59：95－133.

［14］Boldyreff B，Mietens U，Issinger O G.Structure of protein kinase CK2：dimerization of the humanβsubunit［J］.FEBS Lett，1996，379（2）：153－156.

［15］Marin O，Meggio F，Sarno S，et al.Physical dissection of the structural elements responsible for regulatory properties and intersubunit interactions of protein kinase CK2β－subunit［J］.Biochemistry，1997，36（23）：7192－7198.

［16］Chantalat L，Leroy D，F(xiàn)ilhol O，et al.Crystal structure of the human protein kinase CK2regulatory subunit reveals its zinc finger－mediated dimerization［J］.EMBO J，1999，18（11）：2930－2940.

［17］Graham K C，Litchfield D W.The regulatoryβ－subunit of protein kinase CK2mediates formation of tetrameric CK2complexes［J］.J Biol Chem，2000，275（7）：5003－5010.

［18］Bj?rling－Poulsen M，Siehler S，Wiesmüller L，et al.The regulatoryβ－subunit of protein kinase CK2 negatively influences p53－mediated allosteric effects on Chk2 activation［J］.Oncogene，2005，24（40）：6194－6200.

［19］阮 杰，王菲菲，劉新光，等.蛋白激酶CK2βsiRNA對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549增殖的抑制作用［J］.中國(guó)腫瘤臨床，2009，36（12）：10.

［20］郭 澍，孫長(zhǎng)伏，王玉新.蛋白激酶CK2β在腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞中的表達(dá)及意義［J］.中國(guó)腫瘤臨床，2007，17（4）：536－538.

［21］French A C，Luscher B，Litchfield D W.Development of a stabilized form of the regulatory CK2βsubunit that inhibits cell proliferation［J］.J Biol Chem，2007，282（40）：29667－29677.

［22］Deshiere A，Duchemin－Pelletier E，Spreux E，et al.Regulation of epithelial to mesenchymal transition：CK2βon stage［J］.Mol Cell Biochem，2011，356（1－2）：11－20.

［23］Olsen B B，Guerra B.Ability of CK2βto selectively regulate cellular protein kinases［J］.Mol Cell Biochem，2008，316（1－2）：115－126.

［24］Yde C W，Olsen B B，Meek D，et al.The regulatoryβ－subunit of proteinkinase CK2regulates cell－cycle progression the onset of mitosis［J］.Oncogene，2008，27（37）：4986－4997.

［25］Pinna L A，Meggio F.Protein kinase CK2（“casein kinase－2”）and its implication in cell division and proliferation［J］.Prog Cell Cycle Res，1997，3：77－97.

［26］許維恒，張俊平.蛋白激酶CK2抑制劑的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2012，39（2）：143－145.

［27］黃軼軒，周少華，薛洪省.蛋白激酶CK2與人類惡性腫瘤［J］.中國(guó)肺癌雜志，2009，201（7）：439－441.

［28］Daya－Makin M，Sanghera J S，Mogentale T L，et al.Activation of a tumour－associated protein kinase（p40TAK）and casein kinase II in human squamous cell carcinomas and adencarcinomas of the lung［J］.Cancer Res，1994，54（8）：2262－2268.