昆蟲病原線蟲和共生細(xì)菌定殖關(guān)系的研究進(jìn)展

王立婷，丘雪紅，吳春艷，4，陳鏡華，韓日疇*

(1.中國科學(xué)院華南植物園，廣州 510650;2.廣東省昆蟲研究所，廣州 510260;3.中國科學(xué)院研究生院，北京 100039;4.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275)

近年來，環(huán)境及食品安全問題日益突出，人們對使用生物農(nóng)藥取代傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥防治農(nóng)林蟲害的訴求也日漸強(qiáng)烈。斯氏屬Steinernema 與異小桿屬Heterorhabditis 昆蟲病原線蟲(entomopathogenic nematodes，EPNs)是高效而安全的生物殺蟲劑，分別與致病桿菌屬Xenorhabdus和發(fā)光桿菌屬Photorhabdus 共生細(xì)菌互惠共生，在害蟲的安全防治中發(fā)揮了重要作用，受到了科學(xué)界和商業(yè)界的高度重視(Georgis et al.，2006;Kaya et al.，2006)。

感染期幼蟲(infective juveniles，IJs)是昆蟲病原線蟲一生中唯一具有侵染能力和可自由生活于寄主體外的蟲態(tài)，其腸道攜帶特異的共生細(xì)菌。在自然界，感染期線蟲存在于土壤中，主動(dòng)搜索適合的昆蟲寄主，利用蟲體的自然開口(如肛門、氣門)或節(jié)間膜進(jìn)入昆蟲血腔，并釋放腸腔中攜帶的共生細(xì)菌(Strauch and Ehlers，1998;Ciche and Ensign，2003)殺死昆蟲。共生細(xì)菌還產(chǎn)生胞外酶、抗菌素等物質(zhì)，分解昆蟲尸體，為線蟲的生長和繁殖提供理想的環(huán)境(Akhurst，1980，1983;Goodrich-Blair and Clarke，2007;Clarke，2008)。昆蟲體內(nèi)線蟲密度高和營養(yǎng)匱乏時(shí)便形成可攜菌的感染期幼蟲(Wang and Bedding，1996;Cagnolo et al.，2004)。

昆蟲病原線蟲與共生細(xì)菌的共生關(guān)系表現(xiàn)為共生細(xì)菌為線蟲生長發(fā)育提供營養(yǎng)，同時(shí)作為關(guān)鍵的殺蟲因子，線蟲作為載體將共生細(xì)菌攜帶進(jìn)入昆蟲體內(nèi)(Goodrich-Blair and Clarke，2007)。共生細(xì)菌于感染期線蟲腸道中的定殖是昆蟲病原線蟲與共生細(xì)菌互惠共生關(guān)系中的關(guān)鍵時(shí)期(Goodrich-Blair and Clarke，2007)。定殖關(guān)系具有嚴(yán)格的種屬特異性，從自然界分離的每種異小桿或斯氏線蟲都被特定的細(xì)菌定殖(Akhurst，1983;Han et al.，1990)。將線蟲培養(yǎng)于非特異共生的細(xì)菌可獲得腸道不帶菌的感染期線蟲(Han and Ehlers，1998;Ciche and Ensign，2003)。在昆蟲病原線蟲商業(yè)化生產(chǎn)過程中，線蟲與共生細(xì)菌組成單菌培養(yǎng)體系(Bedding，1981;Wouts，1981;Lunau et al.，1993)。因此，研究共生細(xì)菌與昆蟲病原線蟲之間的定殖關(guān)系對這類生物殺蟲劑的致病力和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)都具有重要意義(Ffrench-Constant et al.，2003;Ehlers et al.，2004;Ciche et al.，2006)，也為共生細(xì)菌的分子機(jī)制研究提供了良好的生物模型(Goodrich-Blair and Clarke，2007)。本文從定殖過程、定殖位點(diǎn)、定殖相關(guān)基因和調(diào)控因子以及定殖研究方法概述昆蟲病原線蟲和共生細(xì)菌定殖關(guān)系的研究進(jìn)展，為理解自然界中廣泛存在的微生物共生分子機(jī)制提供參考。

1 定殖的過程及定殖位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)

共生細(xì)菌對IJs 的定殖過程具有階段性，主要包括起始與增殖階段。致病桿菌與發(fā)光桿菌于線蟲寄主體內(nèi)的定殖位點(diǎn)有較大差異。對共生細(xì)菌定殖過程及定殖位點(diǎn)的研究有助于理解細(xì)菌定殖于線蟲的機(jī)理。

1.1 致病桿菌在斯氏線蟲腸道內(nèi)的定殖

研究發(fā)現(xiàn)，共生細(xì)菌X.nematophila 約1個(gè)或幾個(gè)菌體細(xì)胞便可開始對斯氏屬線蟲S.carpocapsae的定殖;這些細(xì)菌在斯氏屬線蟲腸道內(nèi)繁殖并形成50-200 CFU/IJ 的穩(wěn)定種群(Martens et al.，2003)。致病桿菌在斯氏屬線蟲中的定殖位點(diǎn)是腸道前端的一個(gè)特化結(jié)構(gòu):菌囊(Bird and Akhurst，1983;Martens et al.，2003;Martens and Goodrich-Blair，2005)。菌囊在致病桿菌定殖前便形成(Bird and Akhurst，1983)，但共生細(xì)菌的存在會影響菌囊的大小及形狀，沒有被定殖的菌囊比被定殖的菌囊更短更寬，隨著感染期線蟲保存時(shí)間的增加，單條線蟲攜菌量下降，菌囊也會變得更短(Flores-Lara et al.，2007)。X.nematophila 細(xì)菌在菌囊內(nèi)附著在統(tǒng)稱為內(nèi)囊結(jié)構(gòu)(intravesicular structures，IVS)的球狀體無核簇(Martens and Goodrich-Blair，2005)。球狀體沒有明顯的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間隙包含以麥胚凝集素應(yīng)答的粘液類物質(zhì)(Martens and Goodrich-Blair，2005)。IVS 以及粘液類物質(zhì)在定殖中的功能仍未明了，可能起到營養(yǎng)及特異性附著的作用。在感染期線蟲體內(nèi)，菌囊的前端通過一個(gè)保持開放的管狀結(jié)構(gòu)與食道連通(Snyder et al.，2007)，X.nematophila 需要通過這個(gè)連接結(jié)構(gòu)進(jìn)入定殖位點(diǎn)。這一連接結(jié)構(gòu)似乎起著一個(gè)限制性位點(diǎn)的作用，防止非特異性共生細(xì)菌進(jìn)入菌囊(Snyder et al.，2007)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)或許可以幫助理解為何將線蟲培養(yǎng)于非特異共生的細(xì)菌，可獲得腸道不攜菌的感染期線蟲。類似的特異性選擇同樣存在于費(fèi)氏弧菌Vibrio fischeri 對夏威夷短尾魷魚Euprymna scolopes 的定殖過程中(Nyholm et al.，2000)。也許在S.carpocapsae 線蟲體內(nèi)，這種粘液狀物質(zhì)同樣存在于菌囊與食道的連接處，通過識別與粘附X.nematophila 菌體表面的特異結(jié)構(gòu)，將細(xì)菌細(xì)胞“送入”目的地(Goodrich-Blair，2007)。

顯微觀察顯示，X.nematophila 只定殖于線蟲菌囊內(nèi)靠近腸道的遠(yuǎn)端部分，此區(qū)域的末端似乎是關(guān)閉的，阻斷了菌囊與腸道的連通(Snyder et al.，2007)。當(dāng)攜帶共生細(xì)菌的感染期線蟲持續(xù)暴露于昆蟲血淋巴中，菌囊后部的X.nematophila 向前端移動(dòng)，達(dá)到與食道的管狀連接處位置從而充滿了整個(gè)菌囊，然后通過狹窄的后部末端通道，進(jìn)入腸道并從肛門排出(Snyder et al.，2007)。共生細(xì)菌被限制于菌囊遠(yuǎn)端區(qū)域的可能原因有兩個(gè):一是線蟲菌囊內(nèi)充滿了類似粘液的無定形基質(zhì)(很可能與IVS 周圍分布的粘液類物質(zhì)相關(guān))，X.nematophila 細(xì)胞“嵌入”這種基質(zhì)中(Snyder et al.，2007)，它限制了細(xì)菌的可動(dòng)性并促進(jìn)菌囊分區(qū)(Goodrich-Blair，2007);二是線蟲寄主在運(yùn)動(dòng)過程中自然發(fā)生的肌肉收縮反應(yīng)也可促使菌囊被分隔為兩個(gè)不連續(xù)的區(qū)域(Martens and Goodrich-Blair，2005;Goodrich-Blair，2007)。

一些學(xué)者報(bào)道了斯氏線蟲屬不同種的菌囊壁結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)差異。斯氏線蟲S.glaseri 與另一種斯氏線蟲的菌囊壁厚度不同但都具有微絨毛，而構(gòu)成S.carpocapsae 與S.feltiae 菌囊壁的細(xì)胞卻沒有微絨毛結(jié)構(gòu)(Bird and Akhurst，1983;Endo and Nickle，1995;Snyder et al.，2007)。線蟲菌囊壁定殖位點(diǎn)結(jié)構(gòu)上的多變性可能也參與了特異性選擇細(xì)菌的過程(Snyder et al.，2007)。

1.2 發(fā)光桿菌在異小桿線蟲腸道內(nèi)的定殖

與致病桿菌不同，發(fā)光桿菌屬細(xì)菌特異性附著于線蟲寄主腸道的前端細(xì)胞，然后以不同程度延伸至腸道其它部分甚至布滿整條腸道(Ciche and Ensign，2003)。最近研究表明，共生細(xì)菌的傳遞實(shí)際上是來源于母體(Ciche et al.，2008)。雌雄同體的成蟲取食細(xì)菌，一些共生細(xì)菌細(xì)胞不被咽壓碎而進(jìn)入腸道，特異性附著于末端腸上皮細(xì)胞INT9，隨后遷移并感染鄰近的直腸腺細(xì)胞(rectal gland cells，RGCs)，以包涵著細(xì)菌的小液泡方式在RGCs 內(nèi)繁殖。卵在成蟲體內(nèi)孵化后，子代幼蟲以母體為食并發(fā)育，進(jìn)行著噬母(endotokia matricida)過程。此時(shí)母體直腸腺細(xì)胞破裂，發(fā)光桿菌被釋放至體腔中，可被幼蟲攝取。新形成的IJs 被單個(gè)細(xì)菌定殖，菌體細(xì)胞特異性粘附在IJs咽部后方的前腸瓣膜細(xì)胞(pre-intestinal valve cell，PIVC)上，并繁殖至100 CFU 的種群密度。發(fā)光桿菌定殖線蟲腸道可分三個(gè)階段:母體直腸腺的定殖、IJs 腸道的定殖、IJs 定殖位點(diǎn)的繁殖(Ciche et al.，2008)。

定殖位點(diǎn)超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察顯示，共生細(xì)菌侵染母體直腸腺細(xì)胞RGCs時(shí)，包涵著細(xì)菌的小液泡不斷擴(kuò)張并分裂，一種顆粒狀的連接物將它們串聯(lián)在一起使其無法分散。侵染過程中小液泡膜總是清晰可見，直到母體的RGCs 破裂。感染期線蟲不取食，定殖于其腸道的共生細(xì)菌達(dá)到一定種群密度后便會停止增殖，推測進(jìn)入半休眠狀態(tài)，不會被沒有營養(yǎng)來源的IJs 消化。在一些異小桿線蟲的感染期幼蟲腸道內(nèi)，定殖的發(fā)光桿菌似乎被一層非細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基質(zhì)或者膜保護(hù)著，防止它們被寄主消化(Ciche，et al.，2008)。

2 與定殖相關(guān)的基因與調(diào)控因子

定殖過程中，共生細(xì)菌與線蟲之間特異的分子和細(xì)胞界面活動(dòng)是由遺傳因子決定的。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，定殖關(guān)系的相關(guān)基因涉及細(xì)胞表面特異性決定因子、菌毛結(jié)構(gòu)、生物代謝以及細(xì)胞外膜脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)合成途徑等，定殖關(guān)系的一些調(diào)控基因也已被鑒定并研究。了解參與定殖的基因及其調(diào)控機(jī)制對闡明共生關(guān)系分子機(jī)理具有重要意義。

2.1 致病桿菌的定殖基因與調(diào)控因子

研究表明，預(yù)測編碼膜蛋白的三個(gè)基因nilA、nilB、nilC(nematode intestine localization)是X.nematophila 特異性定殖線蟲寄主所必需的(Heungens et al.，2002;Cowles and Goodrich-Blair，2004)。這三個(gè)nil 基因位于同一大小約3.5 kb 的基因座，nilA 編碼90個(gè)氨基酸的內(nèi)膜蛋白，nilC 編碼282個(gè)氨基酸的膜間質(zhì)導(dǎo)向脂蛋白(Cowles and Goodrich-Blair，2004)，nilB 則編碼466個(gè)氨基酸的普遍存在于粘膜性病原菌的外膜(桶型蛋白(Heungens et al.，2002)。NilB 的(桶結(jié)構(gòu)模型具有14個(gè)穿膜氨基酸鏈，7個(gè)細(xì)胞表面環(huán)以及N 端球狀結(jié)構(gòu)域。插入及刪除突變證實(shí)了6 號細(xì)胞表面環(huán)狀結(jié)構(gòu)及N 端球狀結(jié)構(gòu)域在起始定殖過程中起關(guān)鍵作用(Bhasin et al.，2012)。有趣的是，nilABC 基因?yàn)閄.nematophila 所特有，賦予其?；远ㄖ砈.carpocapsae 線蟲的能力。盡管Nil 蛋白的作用機(jī)制仍未明了，但已有人提出這些蛋白可能是細(xì)菌細(xì)胞與IVS 相互作用的特異決定因子，通過特異性識別或粘附過程直接作用于線蟲體內(nèi)環(huán)境而促進(jìn)定殖(Cowles and Goodrich-Blair，2004，2006，2008)。

類似于Nil 蛋白，菌毛結(jié)構(gòu)可能也是與寄生環(huán)境直接發(fā)生作用的共生細(xì)菌細(xì)胞表面特異決定因子(Martens and Goodrich-Blair，2005;Chandra et al.，2008)。革蘭氏陰性菌中，細(xì)胞表面菌毛介導(dǎo)了細(xì)菌細(xì)胞對生物(Stabb and Ruby，2003)及非生物(Otto et al.，2001)目標(biāo)表面的粘附作用。一些病原微生物利用菌毛對靶細(xì)胞表面糖蛋白的特異性結(jié)合來侵染寄主組織細(xì)胞(Tullus et al.，1992;Connell et al.，1996)。X.nematophila 可合成一種耐甘露糖(mannose-resistant，Mrx)的分子伴侶引導(dǎo)型菌毛(He et al.，2004)，其編碼基因一般為含有5個(gè)結(jié)構(gòu)基因的mrx 操縱子，可被全局性調(diào)控因子Lrp 正向調(diào)控及CpxR 負(fù)向抑制(He et al.，2004;Tran et al.，2009)。最新的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在昆蟲寄主活體培養(yǎng)條件下，Mrx 菌毛為X.nematophila 定殖線蟲提供了一個(gè)具有競爭力的優(yōu)勢(Snyder et al.，2011)。

起始定殖后，共生細(xì)菌可在定殖位點(diǎn)增殖說明它們獲得了營養(yǎng)。Martens 等(2005)發(fā)現(xiàn)一些X.nematophila 的代謝突變體可起始定殖但無法在定殖位點(diǎn)正常繁殖，這說明S.carpocapsae 定殖位點(diǎn)的營養(yǎng)環(huán)境對于共生細(xì)菌并不十分適合。serC、thrC、aroA、aroE、pabA、trpE、tyrA-pheA、leuB、tdk 等突變菌株均具有不同程度的定殖能力缺陷，這些基因涉及了甲硫氨酸、蘇氨酸、對氨基苯甲酸及維生素B6等代謝過程(Martens et al.，2005;Orchard and Goodrich-Blair，2005)。其中甲硫氨酸、蘇氨酸生物合成途徑對共生細(xì)菌定殖能力的影響表現(xiàn)得尤為顯著。這些結(jié)果顯示共生細(xì)菌的增殖對甲硫氨酸及蘇氨酸需求較高，但線蟲定殖環(huán)境中的甲硫氨酸及蘇氨酸含量有限。PixA是致病桿菌細(xì)胞中富含甲硫氨酸的一個(gè)胞內(nèi)晶體蛋白，可在定殖時(shí)期表達(dá)。X.nematophila 的pixA 突變體在定殖線蟲腸道的能力方面要比野生型具有優(yōu)勢，這說明在定殖過程中，PixA 的合成可能是個(gè)代謝負(fù)擔(dān)，降低了共生細(xì)菌在線蟲環(huán)境中的適應(yīng)能力(Goetsch et al.，2006)。代謝途徑中斷可能會導(dǎo)致某種中間體物質(zhì)在細(xì)菌細(xì)胞中的過量積累，從而影響X.nematophila 在菌囊中的增殖能力。另一方面，這些生物合成途徑可能影響維持斯氏屬線蟲與致病桿菌屬細(xì)菌共生關(guān)系信號物質(zhì)的產(chǎn)生(Goodrich-Blair，2007)。此外，預(yù)測編碼X.nematophila 細(xì)胞Fe-S 裝配裝置的iscRSUA-hscBA-fdx 基因座協(xié)同表達(dá)也被證明是定殖線蟲寄主所必需的(Martens，2003)。

NilR、Lrp、CpxR、RpoS 被證明是Xenorhabdus 共生細(xì)菌與Steinernema 線蟲間寄生關(guān)系所必需的調(diào)控因子。NilR為包含α 螺旋-轉(zhuǎn)角-α 螺旋結(jié)構(gòu)的DNA 結(jié)合蛋白，抑制著定殖必需基因nilA、nilB、nilC 的表達(dá)(Cowles and Goodrich-Blair，2006)。NilR 的異位表達(dá)導(dǎo)致X.nematophila 定殖水平降低，這可能是由于nilA、nilB、nilC 基因沒有得到足夠的脫阻抑作用(Cowles and Goodrich-Blair，2006)。

全局性調(diào)控因子Lrp、CpxR 正是通過與小轉(zhuǎn)錄因子NilR 的協(xié)同作用(Cowles and Goodrich-Blair，2004，2006)，調(diào)節(jié)nil 基因座的表達(dá)從而影響嗜線蟲致病桿菌定殖能力(Herbert et al.，2007，2009)。lrp 基因編碼亮氨酸應(yīng)答的調(diào)控蛋白Lrp，調(diào)控著X.nematophila 中約65% 的蛋白表達(dá)，其中包括了對定殖因子nil 基因的抑制作用(Cowles et al.，2007)。值得注意的是，X.nematophila 的lrp基因突變反而導(dǎo)致定殖水平與線蟲產(chǎn)量的降低，而nilR 突變體并沒有相似的表型。這說明lrp 突變導(dǎo)致的定殖缺陷不是由于nil 基因脫阻抑導(dǎo)致的，Lrp 可能還調(diào)控著其他未知的定殖因子(Cowles et al.，2007)。同時(shí)，Lrp 還調(diào)控著許多代謝相關(guān)基因，所以lrp 突變體菌株無法在定殖位點(diǎn)正常增殖可能是因?yàn)椴磺‘?dāng)?shù)拇x指令所導(dǎo)致的(Cowles et al.，2007)。CpxRA 雙元信號系統(tǒng)調(diào)控著X.nematophila 中膜定位及分泌型蛋白的基因表達(dá)，是致病桿菌病原性與共生性所必需的(Herbert et al.，2007)。cpxR 基因的突變影響了X.nematophila的定殖能力，這是由于受其正向調(diào)控的nil 基因沒有得到足夠的脫抑制作用而正常表達(dá)(Herbert et al.，2009)?？偨Y(jié)起來，在X.nematophila 感染和生長早期不需要定殖因子時(shí)，nil 基因的表達(dá)受Lrp調(diào)節(jié)子的抑制，而在需要傳遞到新寄主時(shí)的繁殖后期又受CpxR 的誘導(dǎo)而表達(dá)(Richards and Goodrich-Blair，2009)。CpxRA和Lrp 調(diào)節(jié)子具有多 效 性(Herbert et al.，2007;Cowles et al.，2007)。CpxR 正向影響X.nematophila 細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性、分泌型脂肪酶活性及定殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄;反向影響溶血素、蛋白酶、抗菌素活性及菌毛蛋白編碼基因mrxA 的表達(dá)(Herbert et al.，2007，2009)。Lrp 正向調(diào)節(jié)X.nematophila 中多種溶血素基因，反向調(diào)節(jié)線蟲腸道定殖基因nilA、nilB、nilC 的表達(dá)(Cowles and Goodrich-Blair，2004，2005;Cowles et al.，2007)。同時(shí)，Lrp 調(diào)節(jié)子還能作為細(xì)胞內(nèi)代謝狀態(tài)的傳感器(Cowles et al.，2007;Herbert and Goodrich-Blair，2007)，通過變動(dòng)營養(yǎng)可用性來達(dá)到對適應(yīng)性的協(xié)調(diào)。這種對外界環(huán)境變化的感應(yīng)和響應(yīng)在寄主-微生物之間關(guān)系中極為重要(丘雪紅等，2010)。

定殖因子受到抑制表明它們在生活周期的其他階段(如昆蟲感染期)對共生細(xì)菌可能是不需要的(Goodrich-Blair and Clarke，2007;丘雪紅等，2010)。為了互惠共生關(guān)系，線蟲與共生細(xì)菌都需要付出一定的代價(jià)。不帶菌S.carpocapsae IJs存活時(shí)間要比攜菌的長，這表明不取食的感染期線蟲需要消耗自身為腸道中共生細(xì)菌的生長提供營 養(yǎng)(Mitani et al.，2004;Emelianoff et al.，2007)。對于共生細(xì)菌來說，IJs 體內(nèi)的定殖位點(diǎn)是個(gè)營養(yǎng)有限且具有壓力的生存環(huán)境(Martens et al.，2005;Goodrich-Blair，2007)。X.nematophila穩(wěn)定期(S因子RpoS 對于定殖是必需的，rpoS 突變體具有與野生型一致的體外生長能力及對昆蟲的致病力，但無法定殖線蟲寄主(Vivas and Goodrich-Blair，2001)。在許多革蘭氏陰性菌中，(S作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控一系列抵御環(huán)境壓力及寄主關(guān)系相關(guān)操縱子的轉(zhuǎn)錄(Vivas and Goodrich-Blair，2001)。也許在X.nematophila 定殖過程中，RpoS 誘導(dǎo)表達(dá)的操縱子可以幫助細(xì)菌適應(yīng)線蟲寄主的定殖環(huán)境(Goodrich-Blair，2007)。

2.2 發(fā)光桿菌的定殖基因與調(diào)控因子

全基因組測序結(jié)果分析表明，P.luminescens TT01 基因組中包含了大量與共生關(guān)系相關(guān)的基因(Duchaud et al.，2003)。一些與食物信號以及營養(yǎng)作用相關(guān)的基因業(yè)已被報(bào)道(Bintrim and Ensign，1998;Ciche et al.，2001;Joyce and Clarke，2003;Watson et al.，2005;Joyce et al.，2008)，但對于發(fā)光桿菌?；远ㄖ尘€蟲的分子機(jī)制仍然缺乏了解(Gaudriault et al.，2006)。

pbgPE 操縱子是發(fā)光桿菌中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與共生相關(guān)的基因。P.luminescens 的pbgPE 操縱子與哺乳動(dòng)物病原沙門氏菌 Salmonella enterica 的pmrHFIJKLM 操縱子同源。pmrHFIJKLM 編碼的蛋白參與細(xì)菌細(xì)胞膜脂多糖(LPS)的合成與修飾，從而提高細(xì)菌對寄主產(chǎn)生的抗菌肽(CAMPs)等物質(zhì)的抵抗能力(Gunn et al.，1998，2000)。pbgPE 基因的突變使得共生細(xì)菌對抗菌肽物質(zhì)更為敏感，同時(shí)也使得P.luminescens 無法定殖線蟲(Bennett and Clarke，2005;Easom et al.，2010)，這說明pbgPE 操縱子是發(fā)光桿菌病原性和共生性所必需的(Bennett and Clarke，2005)。這種抵御寄主抗菌肽的能力促進(jìn)了Salmonella typhimurium對Caenorhabditis elegans 線蟲的持續(xù)感染(Alegado and Tan，2008)。這一發(fā)現(xiàn)提示我們，pbgPE 突變體的定殖缺陷可能是由于該突變體不能抵抗線蟲母體腸細(xì)胞所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)。也許發(fā)光桿菌也必須克服線蟲的體液免疫反應(yīng)才能完成定殖過程。

Easom 等(2010)發(fā)現(xiàn)，除pbgPE 操縱子外，galU 與galE 基因也參與了LPS 生物合成，同時(shí)也影響共生細(xì)菌 P.luminescens TT01 對 H.bacteriophora 線蟲的定殖能力。galU 與galE 的突變導(dǎo)致P.luminescens 失去對昆蟲的致病力，同時(shí)也無法起始定殖線蟲，這可能是它們的LPS 生物合成途徑受到影響的緣故。pbgPE、galE 及galU基因的鑒定充分暗示了細(xì)胞外膜LPS 在發(fā)光桿菌定殖線蟲中的重要作用;asmA 與proQ 基因被發(fā)現(xiàn)也參與了發(fā)光桿菌的定殖過程(Easom et al.，2010)。

非特異共生的發(fā)光桿菌無法附著 H.bacteriophora 成蟲的INT9 細(xì)胞，從而無法通過感染母體直腸腺細(xì)胞而傳播至下一代感染期線蟲。與Xenorhabdus—Steinernema 類似，發(fā)光桿菌的專化性定殖關(guān)系似乎也存在著特異的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)識別作用。P.luminescens TT01 基因組中含11個(gè)預(yù)測編碼菌毛的基因座，其中有兩個(gè)已被鑒定并報(bào)道(Meslet-Cladiere et al.，2004;Somvanshi et al.，2010)。mad(maternal-adhesion-defective)操縱子含有8個(gè)結(jié)構(gòu)基因，預(yù)測編碼一種細(xì)胞表面的分子伴侶引導(dǎo)型菌毛。madA 突變體無法附著線蟲母體腸細(xì)胞，從而無法正常傳播至異小桿感染期線蟲(Somvanshi et al.，2010);另一個(gè)編碼菌毛結(jié)構(gòu)的操縱子mrf 含有9個(gè)結(jié)構(gòu)基因，但它在定殖過程中是否起到作用還未被鑒定(Meslet-Cladiere et al.，2004)。

開始定殖后，由于不取食的感染期線蟲體內(nèi)能量儲備有限(Selvan et al.，1993)，定殖在線蟲腸道內(nèi)的共生細(xì)菌必須及時(shí)做出調(diào)整，降低對寄主的營養(yǎng)依賴性以適應(yīng)環(huán)境。此時(shí)，共生細(xì)菌除了啟動(dòng)饑餓機(jī)制外，還誘導(dǎo)細(xì)胞酸化以降低生長速度，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝也從三羧酸循環(huán)(TCA)轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵛焯谴x途徑(PPP)以克服氧化應(yīng)激及營養(yǎng)匱乏，同時(shí)還降低了細(xì)胞能動(dòng)性并形成生物被膜以增加定殖的持久性(An and Grewal，2010)。這些細(xì)胞活動(dòng)的變化是發(fā)光桿菌在線蟲腸道內(nèi)進(jìn)行著大量基因轉(zhuǎn)錄水平的重調(diào)所產(chǎn)生的適應(yīng)性結(jié)果。An 等(2010)發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)與定殖于IJs 腸道的P.temperate 細(xì)菌表達(dá)水平不同的包括細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、調(diào)控、壓力應(yīng)答、核酸修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、代謝途徑以及一些未知的轉(zhuǎn)錄單元7類基因。其中嘌呤代謝相關(guān)基因purL 的突變使得與其體外共培養(yǎng)的線蟲無法形成子代感染期幼蟲(An and Grewal，2011)，這是由于細(xì)菌形成生物被膜的能力下降所導(dǎo)致的。鑒于嘌呤代謝在脂多糖(LPS)生物合成中的重要作用，purL 基因突變可能通過影響LPS 的修飾從而無法正確形成生物被膜結(jié)構(gòu)。事實(shí)上，LPS 的遺傳修飾影響共生關(guān)系中微生物在寄主體內(nèi)的寄生，這種現(xiàn)象已在許多互惠共生關(guān)系如費(fèi)氏弧菌Vibrio fischeri 與夏威夷短尾魷 魚Euprymna scolopes(DeLoney et al.，2002;Adin et al.，2008)、氣單胞菌Aeromonas spp 與水蛭leeches(Braschler et al.，2003)、中華根瘤菌Sinorhizobium fredii 與豆科植物legumes(Buendia-Claveria et al.，2003)中發(fā)現(xiàn)。

已發(fā)現(xiàn)的參與發(fā)光桿菌定殖異小桿線蟲的調(diào)控因子有HexA 與HdfR(Joyce and Clarke，2003;Easom and Clarke，2011)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白HexA是共生關(guān)系的抑制蛋白，與野生型菌相比，hexA 突變體能支持更多線蟲的生長發(fā)育(Joyce and Clarke，2003)。微點(diǎn)陣分析顯示HexA 抑制了發(fā)光桿菌中包括晶體蛋白的產(chǎn)生等幾個(gè)活性(Joyce and Clarke，2003)，但被其直接調(diào)控的定殖因子還未被鑒定。同時(shí)hexA 突變體顯著減弱了對昆蟲的毒力，這表明HexA 參與調(diào)控了發(fā)光桿菌病原性與共生性之間的轉(zhuǎn)換(Joyce and Clarke，2003;Joyce et al.，2006)。hdfR 基因編碼一種LysR 型調(diào)節(jié)子，調(diào)控了P.luminescens TT01 中約124個(gè)基因的表達(dá)，這些基因涉及了精氨酸的代謝、羥基苯乙酸酯的分解以及色素的產(chǎn)生(Easom and Clarke，2011)。相較于野生型菌株，hdfR 突變菌株在感染線蟲母體直腸腺細(xì)胞及后代發(fā)育的“噬母”過程中均出現(xiàn)了明顯的滯后效應(yīng)，并影響感染期幼蟲定殖率。微點(diǎn)陣數(shù)據(jù)顯示，hdfR 的突變導(dǎo)致TT01共生細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)代謝出現(xiàn)微調(diào)，但這種變化不影響突變株在線蟲母體內(nèi)的繁殖能力。是何種機(jī)制驅(qū)使發(fā)光桿菌侵染線蟲母體直腸腺細(xì)胞仍不清楚，hdfR 突變株具有正常的母體內(nèi)繁殖能力卻有著極低的液泡形成率，預(yù)示著細(xì)菌可能產(chǎn)生某種未被鑒定的信號物質(zhì)促使小液泡的形成(Easom and Clarke，2011)。最后，HdfR 還調(diào)控了兩個(gè)參與細(xì)胞外膜脂多糖(LPS)O 抗原形成的基因wblABCD、wblLGHIJ(Easom and Clarke，2011)，所以hdfR 突變也可能通過影響P.luminescens LPS 的形成從而影響定殖。

3 研究定殖作用的方法

目前研究共生細(xì)菌定殖線蟲的方法主要有IJs頭部切割法、熒光標(biāo)記共生細(xì)菌法以及IJs 組織破碎法。這些方法相輔相成，極大地加速了定殖關(guān)系分子水平研究的進(jìn)程。

3.1 IJs 頭部切割法

為了判斷感染期線蟲腸道是否攜帶共生細(xì)菌，可利用手術(shù)刀片將單個(gè)感染期線蟲的頭部切開，噴出線蟲的前腸，以0.1%的龍膽紫染色后置于顯微鏡下觀察，可見著色的桿狀共生細(xì)菌(Han et al.，1990;Han and Ehlers，1999;Han and Ehlers，2000;Vivas et al.，2001)。這種頭部切割觀察共生細(xì)菌定殖情況的方法快速直觀，不需要對共生細(xì)菌進(jìn)行遺傳改造。缺點(diǎn)是無法進(jìn)行活體觀察，且操作技術(shù)要求較高。

3.2 熒光標(biāo)記共生細(xì)菌法

Ciehe 等(2003)利用轉(zhuǎn)座的方法，將含有綠色熒光蛋白編碼基因gfp 的轉(zhuǎn)座子整合至共生細(xì)菌的基因組中，構(gòu)建出具有綠色熒光表型的共生細(xì)菌。將這種帶有GFP 標(biāo)記的共生細(xì)菌與無菌的卵或感染期幼蟲共培養(yǎng)，當(dāng)?shù)诙腥酒诰€蟲形成后便可通過熒光顯微鏡觀察線蟲腸道的定殖情況。這種方法實(shí)現(xiàn)了定殖的活體持續(xù)性觀察，使得定殖位點(diǎn)以及整個(gè)定殖過程清晰可見。然而，線蟲對含有GFP 標(biāo)記和不含GFP 標(biāo)記的共生細(xì)菌偏好不同。線蟲一般偏好不含GFP 標(biāo)記的共生細(xì)菌，如果將線蟲置于兩者的混合環(huán)境中，線蟲腸道內(nèi)只含有不帶GFP 標(biāo)記的共生細(xì)菌(Ciche and Ensign，2003)。盡管如此，GFP 在多篇報(bào)道中已被證明不會影響共生細(xì)菌的生理生化特性、對昆蟲寄主的病原性以及與線蟲寄主的共生性。它為今后研究共生細(xì)菌在感染期線蟲腸道中的定殖及釋放提供了有價(jià)值的工具。

3.3 IJs 組織破碎法

以上的兩種方法屬于對共生細(xì)菌定殖線蟲的定性檢測手段，無法對每條感染期線蟲的攜菌數(shù)量進(jìn)行準(zhǔn)確的分析。Cowles 等(2002)利用組織破碎的方法對單個(gè)感染期線蟲的攜菌數(shù)量進(jìn)行了定量測定。取單條IJ 或者確定數(shù)目的IJs 進(jìn)行體表消毒，再用一種恒溫水浴聲波儀對線蟲進(jìn)行組織破碎以釋放定殖的共生細(xì)菌，收集組織懸濁液混勻后稀釋至一定倍數(shù)接種至LB 平板上培養(yǎng)，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)以確定每條感染期線蟲定殖的CFU。隨著感染期線蟲儲存時(shí)間的變化，其腸道中定殖的共生細(xì)菌數(shù)量也發(fā)生變化(Emelianoff et al.，2007)。這種定量的方法可為線蟲和共生細(xì)菌復(fù)合體致死昆蟲寄主能力測定提供參考。

4 結(jié)語與展望

昆蟲病原線蟲是應(yīng)用前景廣闊的新型生防因子。這類線蟲與共生細(xì)菌的共生關(guān)系對這類生物殺蟲劑的致病力和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)都極為重要(丘雪紅等，2010)。定殖階段是昆蟲病原線蟲-共生細(xì)菌共生關(guān)系中的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，對定殖分子機(jī)制的研究將極大地促進(jìn)對兩者共生性的理解。多個(gè)共生細(xì)菌全基因組的測序已使定殖關(guān)系的研究有了令人矚目的進(jìn)展，但其具體的作用機(jī)制及完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還未揭去“神秘面紗”。共生細(xì)菌細(xì)胞感應(yīng)線蟲環(huán)境的何種因素從而啟動(dòng)定殖因子的表達(dá)?還有哪些因子參與了特異性定殖作用?隨著后基因組學(xué)分析如功能基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用，介導(dǎo)共生細(xì)菌與昆蟲病原線蟲特異性定殖關(guān)系的分子機(jī)制與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也將日漸明朗。

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