雙陰性T細胞的研究進展

劉晗 張金巧

近年來，免疫調(diào)節(jié)細胞逐漸成為眾專家學者研究的熱點之一，其中αβTCR+CD3+CD4－CD8－T細胞(雙陰性 T細胞，DNT細胞)因其獨特的免疫抑制作用，越來越受到研究學者們的重視，DNT細胞在體外經(jīng)過非己抗原刺激后可以特異性抑制同種同源CD4+和CD8+T細胞的增殖，將DNT細胞回輸后能延長小鼠同種異基因移植皮膚的存活［1］，野生型C57BL/6小鼠的DNT細胞在接受大鼠抗原(脾細胞)刺激后表達B220和CD25，此B220－CD25－DNT細胞可通過穿孔素/顆粒酶途徑溶解同基因的B細胞和T細胞［2］。為方便今后對DNT細胞的研究，本文將對DNT細胞作如下綜述。

1 外周血中有DNT存在

在正常小鼠外周淋巴組織中，大部分αβTCR+T細胞都表達CD4分子或CD8分子，僅有1% ～5%即不表達CD4也不表達CD8，這少數(shù)T細胞即被稱為雙陰性T細胞(DNT細胞)［3］。Fischer等［4］用流式細胞儀檢測分析20例健康人外周血單個核細胞，結(jié)果示:CD3+CD4－CD8－T細胞占 CD3+T細胞的4.1%(1.9% ～7.7%)，其中 γδTCR+DNT 比例較高，占 CD3+T 3.2%(2.1% ～ 3.6%)，αβTCR+DNT 僅占 0.9%(0.4% ～1.9%)，證明正常人體內(nèi)亦存在少量DNT細胞。

2 DNT的來源

2.1 來源于CD8+T細胞 有些實驗提示DNT細胞可能來源于CD8+T細胞表面CD8表達的下調(diào)，支持此說法的主要發(fā)現(xiàn)有:(1)在外周 DNT細胞中存在去甲基化的 CD8基因［5，6］;(2)體外培養(yǎng)CD8+T細胞，經(jīng)IL-4和伊屋諾霉素處理后，能分化成可分泌IL-4及其他Th2細胞因子的DNT細胞［7］;(3)對DNT細胞基因高保守序列進行多個基因位點分析，得出DNT細胞的前體細胞可能是CD8+T細胞［8］;(4)體內(nèi)刺激CD8+T細胞可導致DNT細胞的積累，且在DNT細胞上有過量表達的αβ-TCR Vβ，這與MHCⅠ類抗原篩選途徑相符，亦可認為其來源于 CD8+T 細胞［3］。

盡管如此，亦有許多實驗不支持DNT細胞來源于CD8+T細胞:(1)在某些小鼠模型中所鑒定出來的DNTreg細胞缺乏任何CD8 mRNA的表達［9］;(2)向有抗原表達的小鼠體內(nèi)注射高純度CD8+T細胞，抑或在體外培養(yǎng)CD8+T細胞時加入IL-2和/或 IL-4，CD8+T細胞并未分化出 DNTreg細胞［9］;(3)Ford等［10］用耗盡T細胞的骨髓細胞重建CD8缺乏小鼠和非致死劑量照射致胸腺切除小鼠，證明有DNT細胞出現(xiàn)于CD8-/-小鼠體內(nèi)，并且對同系小鼠CD8+T細胞有抑制性調(diào)節(jié)作用。

2.2 來源于CD4+CD8+雙陽性T(DP T)細胞 DP T細胞在胸腺發(fā)育過程中，需要經(jīng)歷陽性選擇和陰性選擇，只有以適當TCR親和力發(fā)生特異結(jié)合才能最終發(fā)育為CD4單陽或CD8單陽的T細胞，而TCR高親和力則可能有助于DP細胞逃離陰性選擇并最終發(fā)育成為DNT細胞［11］。Wang等［12］在體外培養(yǎng)胸腺來源的DP T細胞，以高親和力抗原刺激此細胞會使此細胞表面CD4、CD8表達水平下調(diào)，并最終分化發(fā)育為對自身幼稚T細胞增殖有抑制作用的DNT。Priatel等［13］的研究已證明部分DP T細胞可逃避胸腺陰性選擇成為DNT細胞，并在外周接受抗原刺激增殖為功能性DNT細胞。

2.3 其他來源 張等［14］的研究證明，可從CD4+CD25－T細胞誘導DNT細胞生成，從C57BL/6(H-2b)小鼠的淋巴結(jié)和脾臟中分離提純CD4+CD25－T細胞進行體外培養(yǎng)，與IL-2和/或IL-15及同種同源骨髓樹突狀細胞(BMDCs)共培養(yǎng)后，CD4基因表達下調(diào)，從而轉(zhuǎn)變?yōu)镈NT細胞，此DNT細胞保留穩(wěn)定的表型，并且高度表達穿孔素，在體外和體內(nèi)均可抗原特異性的抑制同種同型CD4+和CD8+，并可促進B細胞凋亡。Hayes等［15］的研究有另外建議，認為一些DNT細胞產(chǎn)生自前TCR+DN 細胞(晚期 DN3細胞，CD44 CD25+CD4－CD8－)。

3 DNT細胞在各疾病中的作用

3.1 在移植免疫中的作用

3.1.1 移植排斥:Zhang等［16］體外培養(yǎng)由小鼠體內(nèi)分離出的DNT細胞，發(fā)現(xiàn)其能夠抗原特異性地抑制并殺傷對供體有排斥作用的效應性CD8+和CD4+T細胞，在同基因型裸鼠體內(nèi)選擇性植入此細胞后，同種異體移植物的存活時間將被延長。同樣的，對供受者MHCⅠ類抗原不匹配的患者，移植前向受者輸注供者淋巴細胞(DLI)，可激活受者體內(nèi)的DNT細胞，則移植后受者體內(nèi)被供者淋巴細胞激活的DNT細胞可殺傷受者產(chǎn)生的抗供者T細胞，抑制免疫排斥，而對受者其他效應T細胞無殺傷作用，此實驗證實，抗原特異性DNT細胞能通過抑制同種同源效應性T細胞來抑制受者抗供者器官的移植排斥反應［2，17］。

3.1.2 移植物抗宿主病(GVHD):Strober等［18］報導，DNT 細胞在體內(nèi)或者體外均可以抑制免疫反應，他們發(fā)現(xiàn)來自成年鼠脾臟、胸腺和骨髓的DNT細胞或者是克隆群可以抑制體外混合淋巴細胞反應，當與異基因淋巴細胞共注射后可抑制GVHD。Abraham等［19］發(fā)現(xiàn)接受短療程大劑量IL-2處理的小鼠體內(nèi)CD3+CD4－CD8－細胞增多，在骨髓移植后，其GVHD降低但不影響移植物抗白血病效應(graft-versus-leukemia，GVL)和移植排斥。

3.2 在自身免疫性疾病中的作用

3.2.1 下調(diào)免疫反應:DNT細胞可下調(diào)免疫反應，對某些自身免疫疾病有益。在小鼠自身免疫疾病模型中已證實，DNTreg可下調(diào)CD8+T細胞介導的免疫反應，與無抗原小鼠相比，帶有TCR MHC-Ⅰ類抗原特異性轉(zhuǎn)基因的小鼠的DNTreg細胞對同基因小鼠CD8+T細胞的殺傷作用更強，從而下調(diào)自身免疫疾病的免疫反應［13］。在非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠模型中，存在可分泌大量IL-10的DNT細能，將此細胞回輸入NOD模型小鼠體內(nèi)可預防小鼠胰島素依賴性糖尿病的發(fā)生［20］。

DNT細胞誘導凋亡不足也可促進自身免疫疾病進展。Fas突變淋巴細胞增生(lpr)小鼠其活性CD4+、CD8+T細胞表面Fas基因缺陷，以致T細胞凋亡不足，導致非惡性淋巴器官腫大和自身免疫紊亂，以外周血CD3+CD4－CD8－T細胞增多為特征。Ford等［21］發(fā)現(xiàn)在Fas突變淋巴細胞增生(lpr)小鼠模型中積聚的大量DNT細胞同基因但表達功能性Fas受體的CD4+和CD8+T細胞仍有免疫抑制活性，可殺傷Fas+靶細胞，而對Fas－細胞無效，所以推測DNT細胞在體內(nèi)積聚可能是由于這些小鼠體內(nèi)的DNT細胞對Fas－細胞不能產(chǎn)生負性調(diào)控作用，而造成自身反應性增多。

3.2.2 免疫反應促進作用:目前研究發(fā)現(xiàn)除自身免疫性淋巴細胞綜合癥(ALPs)外，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的患者體內(nèi)DNT細胞也大量增加［22，23］。Crispin 等［23］研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎炎的患者腎組織中DNT細胞積聚并分泌IL-17，而外周血中DNT細胞則分泌IFN-γ，這兩種細胞因子均可促進SLE患者腎臟炎癥的發(fā)展。Zhang等［24］隨后在MRL/lpr(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)鼠模型中也發(fā)現(xiàn)高表達IL-17和IL-23R的DNT細胞，并且其濃度與疾病嚴重程度呈正相關(guān)。Kyttaris等［25］用IL-23R處理取自MRL/lpr小鼠淋巴結(jié)的淋巴細胞可誘導出DNT細胞，此DNT細胞亦高表達IL-17，向淋巴細胞缺陷小鼠輸注此DNT細胞后可導致小鼠狼瘡樣腎炎發(fā)生。

3.3 在腫瘤中的作用 目前針對DNT細胞在腫瘤中的作用還研究較少。Young等［26］在做移植模型研究時將DNT細胞和小鼠B細胞淋巴瘤A20細胞株共培養(yǎng)后再接種于(B6xBALB/c)F1小鼠，發(fā)現(xiàn)與單純輸注淋巴瘤A20細胞株的小鼠相比，同時輸注DNT細胞的小鼠淋巴瘤發(fā)生率低，且無GVHD，而且將DNT細胞與淋巴瘤A20細胞株同時肌注于小鼠，可在局部使小鼠淋巴瘤被局限提示DNT細胞可作為淋巴瘤治療的新策略。

4 DNT細胞的作用機制

DNT細胞需通過與反應性T細胞的接觸才能發(fā)揮其免疫抑制作用，而不通過競爭生長因子或占據(jù)APC表面空間(位點)來抑制同源 CD8+T 細胞增殖［2，27］，如用碳酸脂膜系統(tǒng)將DNT細胞與反應性CD8+T細胞隔開，則DNT細胞不能抑制CD8+反應性T細胞的增殖［2］。

除了細胞間接觸，DNT細胞通過TCR獲取與效應T細胞同樣的抗原的抗原的能力也很重要。和其他免疫細胞一樣，DNT細胞也有從鄰近細胞獲取蛋白質(zhì)的能力，而且DNT細胞能將通過TCR從APC獲取的異種抗原表達于自身表面，可被表達相同TCR的CD8+T細胞特異性識別，引起抗原抗體結(jié)合介導的細胞間接觸并觸發(fā)抑制效應，封閉抗原或加入TCR抗體后都可使免疫抑制反應下調(diào)。

Fasl與其受體Fas結(jié)合是誘導T細胞凋亡的重要途徑［27］，活化的CD4+或CD8+T細胞Fas表達逐漸增加，與調(diào)節(jié)性T細胞表面Fasl結(jié)合可誘導效應T細胞凋亡，使特異性免疫反應不致過激，以保持機體的穩(wěn)態(tài)。有研究證實DNT可通過Fas/Fasl相互作用直接殺傷與其相接觸的效應T細胞，當以抗體或融合蛋白封閉DNT細胞上的Fasl后，則其介導的免疫殺傷受抑［2］。

但Young等［26］的研究也表明，阻斷Fas/Fasl途徑并不能完全阻斷DNT細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，這說明DNT還可通過其他的途徑發(fā)揮作用。比如通過分泌各種細胞因子發(fā)揮作用等。

隨著對DNT細胞研究的不斷深入并不斷在更多疾病中擴展，我們對DNT細胞的認識越來越豐富，但目前我們得到的資料大多來源于動物模型，相對于復雜的人體系統(tǒng)來說，想將DNT細胞的理論應用于臨床仍有許多問題需要解決。我們應進一步研究其在不同疾病發(fā)病、進展及轉(zhuǎn)歸過程中上下游的特異基因突變及細胞因子表達、對藥物反應等各方面的變化規(guī)律，以期推動疾病的免疫治療，造福患者。

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