先天性巨結(jié)腸與RET基因突變相關(guān)性研究

牛會忠 王麗亞 耿建磊

先天性巨結(jié)腸(hirschsprung’s disease，HD)亦被稱為腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥，是一種以反復(fù)發(fā)作并逐漸加重的腹脹、排便困難為臨床表現(xiàn)的疾病，是新生兒低位腸梗阻最主要的原因之一，是近年來研究較多的一種常見的消化道發(fā)育畸形。其病理常常表現(xiàn)為：腸道末端神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育完全缺如，HD的發(fā)病率一般認(rèn)為大約為1/5 000［1］，其中男女發(fā)生比例約為4∶1，其中仍以散發(fā)型為主，但近年來發(fā)現(xiàn)，部分病例有典型的家族病史。家族性HD約占總發(fā)病例數(shù)中的3.6% ～7.8%［1］，河北省的先天性巨結(jié)腸的發(fā)病率較高，并有逐年增高趨勢，是嚴(yán)重影響我省新生兒及小兒的生活質(zhì)量的先天性疾病之一。本研究通過分析我院2011年以來收治的40例河北籍巨結(jié)腸患兒RET基因外顯子DNA的表達(dá)變化，并討論HD與RET基因突變的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源及基因組DNA提取 選取我院2011年1月至2012年3月收治的HD患兒共40例，所有患兒均系河北籍，其中男31例，女9例;年齡：2 d～4歲，平均年齡1歲3個月。其中散發(fā)性34例，家族性6例，所有病例均有典型的臨床表現(xiàn)，在術(shù)前經(jīng)過鋇灌腸造影、直腸肛管測壓法及直腸粘膜乙酰膽堿酯酶組織化學(xué)等相關(guān)檢查確診，并經(jīng)過手術(shù)病理證實，均明確診斷為HD，所有患兒無合并其他畸形。另外隨機(jī)選取健康無便秘史相同年齡組河北籍兒童40例作對照組。

所有實驗對象均自愿采取靜脈血1.5～2 ml，抗凝后通過鹽析法提取目標(biāo)基因組相關(guān)DNA片段。

1.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 參照相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計所需引物，并由中國科學(xué)院微生物研究所基因工程中心合成，序列為F：5'-GACTCGTGCTATTTTTCCTC-3'和 R：5'-TATCTTTCCTAGGCTTCCCA-3';PCR擴(kuò)增：每25微升的PCR反應(yīng)體系中應(yīng)包含DNA模板約 100 ng，10 × buffer 5 μl，1.5 mmol/L MgCl2，0.25 μmol/L引物，dNTP各100μmol/L，Taq酶2 U。反應(yīng)體系整體經(jīng)過95℃預(yù)變性5 min 后，以94℃ 30 s，56℃ 30 s，70℃ 60 s循環(huán) 3次，最后予72℃延伸10 min。所得產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳法檢測。

1.3 單鏈構(gòu)象多態(tài)(SSCP)分析及產(chǎn)物測序 制備8%(49∶1)非變性聚丙稀酰胺凝膠，反應(yīng)體系中含5%甘油，5μl PCR產(chǎn)物與適量加樣緩沖液(90%甲酰胺，0.05%溴酚蘭，0.05%二甲苯青)混合，95℃變性5 min后冰浴驟冷，進(jìn)行凝膠電泳20℃，600 V電泳7 h。電泳結(jié)果用銀染進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

通過對40例HD患兒的RET基因第15外顯子的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中僅3例樣本在SSCP電泳中有異常，除正常的兩條單鏈帶型和一條未變性完全殘留的雙鏈帶型外，尚有一條突變帶型，考慮突變帶型為雜合型突變。重復(fù)實驗結(jié)果相同。3例患兒中1例有明確家族史，考慮為家族性HD。對照組40例RET基因15外顯子未見異常。

3 討論

對于HD發(fā)病原理的研究已經(jīng)有了長足的進(jìn)展，有國外學(xué)者最早通過觀察遺傳特征明顯的家族性先天性巨結(jié)腸，對其家系進(jìn)行了連鎖分析，將HD的致病基因初步定位在RET基因。在隨后的研究中證實，在部分散發(fā)性HD患者中也發(fā)現(xiàn)了RET基因的突變。RET基因是近年來作為巨結(jié)腸致病基因中被研究的較多和較充分的基因之一，位于10q11.2，共擁有20個外顯子，編碼了總共包含1 114個氨基酸的跨膜蛋白質(zhì)，隸屬于受體酪氨酸蛋白激酶(RTK)家族，其主要的功能域包括：細(xì)胞外配基連接結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)催化的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，傳統(tǒng)研究認(rèn)為RET基因編碼的跨膜蛋白質(zhì)在神經(jīng)嵴源性的細(xì)胞中均有表達(dá)，并擔(dān)負(fù)重要生物學(xué)功能，可能負(fù)責(zé)將細(xì)胞外的信息轉(zhuǎn)化為可以在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化學(xué)信號［2］。目前國外在RET基因與HD的相關(guān)研究較多，但國內(nèi)在這方面的研究剛剛起步。

HD是一種多基因遺傳疾病，近年來隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，有研究表明，在50%的家族性HD和7% ～35%的散發(fā)性HD病例［3］中發(fā)現(xiàn)了RET基因的突變，而且這些突變均被證實與RET基因功能的降低或缺失有關(guān)。我們的研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實了RET基因的突變和表達(dá)異常與河北地區(qū)先天性巨結(jié)腸發(fā)病密切相關(guān)并具有可遺傳性。

隨著研究的深入，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，RET基因的突變并不僅發(fā)生在編碼區(qū)，表現(xiàn)為外顯子的變異，部分發(fā)生在RET基因內(nèi)含子部分或鄰近區(qū)域的調(diào)節(jié)序列上，通過調(diào)節(jié)或干擾RET基因的表達(dá)發(fā)揮作用，包括缺失、插入、框移、同義、錯義、拼接突變。各個編碼區(qū)不同的突變可以導(dǎo)致合成的酪氨酸激酶各功能域產(chǎn)生相應(yīng)變異，影響其相應(yīng)的功能，從而導(dǎo)致HD的發(fā)病。且RET基因的改變只能解釋一小部分HD的發(fā)病機(jī)制，尚不全面。而占相當(dāng)大比例的非綜合征型、散發(fā)性HD患兒中，檢測到目前已知相關(guān)基因的編碼序列突變是很難的［4］。目前已有許多關(guān)于HD基因突變的報道，僅由某一基因的突變率尚不能解釋全部HD患者病因，尤其是對于散發(fā)性病例，更是難以解釋。故可以推測其他基因和(或)環(huán)境因素多因素均影響HD的發(fā)生：現(xiàn)有的證據(jù)表明大多數(shù)HD為多基因遺傳如RET、GDNF、EDNRB、EDN-3、SOX10 等相關(guān)疾病［5］。國內(nèi)還有散發(fā)性HD患者主要以EDNRB基因突變?yōu)橹鞯南嚓P(guān)報道［6］。還有研究表明SOX10對RET基因的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)節(jié)作用，并可以影響RET基因與EDNRB基因的相互作用［7］。所以單一的基因研究有很大的局限性，其中環(huán)境因素在多基因疾病發(fā)展過程的作用也是不能忽視。

本試驗組中40例患兒也僅3例可見異常泳動帶型。我們認(rèn)為在以下幾個方面可能是導(dǎo)致突變檢出率較低的原因：(1)RET基因共擁有20個外顯子，而我們未能全部檢測，僅僅針對突變率最高的一個外顯子進(jìn)行了相關(guān)檢測，可能應(yīng)該是導(dǎo)致突變率檢出較低的主要原因。在今后的實驗中通過針對更大樣本檢測更多的外顯子有可能明顯提高相關(guān)基因突變率的檢出率;(2)RET基因非編碼區(qū)的突變可能對RET基因表達(dá)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性作用，從而在HD發(fā)生中起重要作用。本研究未能檢測非編碼區(qū)的DNA序列，在一定程度上影響了突變檢出率;(3)HD是一種多基因遺傳病，突變不僅僅發(fā)生在RET基因中，其他基因位點如EDNRB、SOX10、EDN等的突變或受到某些因素影響，相應(yīng)的修飾位點產(chǎn)生調(diào)節(jié)性改變都有可能導(dǎo)致HD的發(fā)病，而這些變化不導(dǎo)致RET基因本身的變異，不能被我們的實驗檢出，降低了檢出率;(4)近年來，我省HD發(fā)病率有升高趨勢，提示地域性因素和周圍環(huán)境因素有可能通過影響一個或多個基因的表達(dá)，在HD這種多基因疾病的發(fā)病中起一定作用，

一般認(rèn)為，HD是一種由多個基因共同影響而導(dǎo)致的的先天性疾病，并不是所有的HD病例都可以通過某一個單一的基因突變來解釋;近年來，雖然分子生物學(xué)等現(xiàn)代化手段有了長足的發(fā)展，但目前人們對于HD的發(fā)病機(jī)制的研究仍處于初步階段，仍很不全面。距離全面理解HD的發(fā)病機(jī)制還有很多工作需要進(jìn)行，仍需我們進(jìn)行更深入更全面的研究。

1 Puri P.Hirschsprung’s disease.In：Oldham TO，Colombani PM，F(xiàn)oglia RP，eds.Surgery of infants and Children.Scientific Principles and Practice.New York：Lippincott-Raven，1997.1277-1299.

2 Bordeaux MC，F(xiàn)oreet C，Granger L，et al.The RET proto-oncogene induces apoptosis：a novel mechanism for Hirschsprung’s disease.EMBOJ，2000，19：4056-4053.

3 Attie T，Pelet A，Edery P，et al.Diversity of RET proto-oncogene mutations in familial and sporadic Hirschsprung disease.Hum Mol Genet，1995，4：1381-1386.

4 劉翠平，李繼承.RET原癌基因與先天性巨結(jié)腸相關(guān)性的分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2008，30：15-18.

5 Brooks AS，Oostra BA，Hofstra RM.Studying the genetics of Hirschsprung’s disease：unraveling an oligogenic disorder.Clin Genet，2005，67：6-14.

6 魏明發(fā)，王果，朱珉，等.先天性巨結(jié)腸癥RET和EDNRB基因的突變.世界華人消化雜志，2004，12：635-638.

7 Owens SE，Broman KW，Wiltshire T，et al.Genome-wide linkage identifies novelmodifier loci of aganglionosis in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.Hum Mol Genet，2005，14：1549-1558.