瘤胃酸中毒的微生物學(xué)研究進(jìn)展

■李 鵬劉敏躍于立輝龍 淼 郭 洋 何劍斌

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機(jī)械研究所有限公司，遼寧沈陽 110036)

瘤胃酸中毒是因反芻動(dòng)物采食大量的谷類或其它富含碳水化合物的飼料后，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)乳酸和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）蓄積而引起的一種代謝性酸中毒。正常情況下，反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)pH值維持在6左右，一般認(rèn)為，瘤胃內(nèi)pH值在5.0～5.6之間發(fā)生亞臨床酸中毒，pH值＜5.0即發(fā)生急性酸中毒。酸中毒時(shí)瘤胃pH值下降，勢(shì)必引起瘤胃內(nèi)微生物種群發(fā)生改變。Hungate研究表明，當(dāng)動(dòng)物攝入過量的碳水化合物時(shí)可以導(dǎo)致瘤胃微生物菌群發(fā)生顯著的變化，這種變化包括以下幾個(gè)方面：①分解纖維素的細(xì)菌數(shù)量急劇減少；②纖毛蟲死亡；③革蘭性陽性菌數(shù)量增加；④非揮發(fā)性酸積聚；⑤揮發(fā)性酸濃度下降[1]。本文主要對(duì)瘤胃酸中毒時(shí)瘤胃內(nèi)微生物學(xué)研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 瘤胃酸中毒與瘤胃內(nèi)細(xì)菌

瘤胃內(nèi)諸如淀粉和糖類等可發(fā)酵底物增加，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)某些細(xì)菌生長速率和發(fā)酵活性增強(qiáng)，進(jìn)而引起瘤胃內(nèi)乳酸和VFA蓄積，發(fā)生酸中毒。瘤胃酸中毒引起的細(xì)菌變化主要包括可發(fā)酵淀粉和可溶性糖類的細(xì)菌以及可發(fā)酵乳酸的細(xì)菌種群的改變。

1.1 淀粉分解菌和產(chǎn)乳酸菌

許多瘤胃內(nèi)細(xì)菌均可以降解淀粉并利用其中間產(chǎn)物（淀粉糊精、麥芽糖、葡萄糖等）。在飼喂高碳水化合物日糧的動(dòng)物中，淀粉分解菌可以占瘤胃內(nèi)細(xì)菌總數(shù)的90%～95%。瘤胃內(nèi)可以利用淀粉、麥芽糊精以及麥芽糖的細(xì)菌種類主要包括：月形單胞菌屬（Selenomonas）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、真菌屬（Eubacterium）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、光崗菌屬（Mitsuokella）、瘤胃桿菌（Ruminobacter）、琥珀酸單胞菌屬（Succinimonas）以及琥珀酸弧菌屬（Succinivibrio）[2]。但有關(guān)每種細(xì)菌的淀粉分解活性以及乳酸和VFA的產(chǎn)量尚不清楚。

1.1.1 反芻月形單胞菌

反芻月形單胞菌，一種月形單胞菌屬的革蘭氏陰性桿菌，是瘤胃中的一種優(yōu)勢(shì)菌種，對(duì)于飼喂富含碳水化合物飼料的動(dòng)物來說其濃度持續(xù)增加。它可能是動(dòng)物適應(yīng)高碳水化合物日糧最主要的一種微生物。反芻月形單胞菌并不發(fā)酵淀粉或其他多糖，但可以利用麥芽糖、糖類和一些寡糖類。因此，它依賴于可降解高分子聚合物的細(xì)菌而存在。基于其利用乳酸和甘油的能力，可以將瘤胃內(nèi)月形單胞菌分成兩類：可以利用乳酸和甘油的菌株被劃分為反芻月形單胞菌乳酸分解亞種（Selenomonas ruminantium ssp.lactilytica），而其它所有菌株全被劃為反芻月形單胞菌反芻亞種（Selenomonas ruminantium ssp.ruminantium）。因此，反芻月形單胞菌既可以產(chǎn)生乳酸又可以利用乳酸。反芻月形單胞菌反芻亞種是瘤胃內(nèi)主要的微生物（約占飼喂谷物飼料動(dòng)物瘤胃內(nèi)細(xì)菌總數(shù)的22%～51%），而反芻月形單胞菌乳酸分解亞種僅占很小的比例[3]。

1.1.2 牛鏈球菌

牛鏈球菌是一種兼性厭氧菌，通常存在于牛的瘤胃、盲腸和結(jié)腸中。在以牧草作為主要飼料的動(dòng)物瘤胃內(nèi)牛鏈球菌數(shù)量并不高（104～107個(gè)/g瘤胃內(nèi)容物），但是當(dāng)碳水化合物發(fā)酵過度時(shí)其數(shù)量可以達(dá)到1011個(gè)/g瘤胃內(nèi)容物。盡管許多瘤胃內(nèi)細(xì)菌可以分解淀粉，但以牛鏈球菌效果最好，這主要是由于牛鏈球菌具有快速的生長速率以及其對(duì)淀粉降解迅速[4]。牛鏈球菌通常是混合酸發(fā)酵模式（產(chǎn)物為乙酸、蟻酸以及乙醇），但當(dāng)?shù)孜镞^量及pH值＜5.6時(shí)其可以轉(zhuǎn)變?yōu)榧內(nèi)樗岚l(fā)酵模式（產(chǎn)物僅是L-乳酸）。盡管純?nèi)樗岚l(fā)酵比混合酸發(fā)酵產(chǎn)生較少的ATP，但牛鏈球菌有著極高的發(fā)酵效率，其每小時(shí)產(chǎn)生的ATP比其他瘤胃內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生的要多。在牛鏈球菌中，可以在乳酸脫氫酶（LDH）的作用下將丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗峄蛟诒嵯佀崃呀饷福≒FL）的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A和蟻酸，隨后乙酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜峄蛞掖?。乳酸產(chǎn)量增加主要是由于當(dāng)菌體外pH值低于5.0時(shí)菌體內(nèi)pH值下降至5.5，而LDH在pH值5.5時(shí)活力最強(qiáng)。相反，PFL的最適pH值為7.5，當(dāng)pH值6.0時(shí)其活力下降10%。此外，兩種酶的活性均受別構(gòu)劑的影響，LDH受果糖-1、6-二磷酸的影響，而PFL受二羥基丙酮磷酸和甘油醛-3-磷酸的影響[5]。牛鏈球菌內(nèi)LDH和PFL的合成可能還受其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[6]。

盡管普遍認(rèn)為牛鏈球菌具有一定的耐酸性，但其耐酸性并沒有乳酸桿菌那樣強(qiáng)，當(dāng)瘤胃pH值＜6.0時(shí)其生長速度下降，且隨著乳酸桿菌數(shù)量的增加鏈球菌數(shù)量減少，表明二者之間可能存在拮抗作用。而Well在1997年發(fā)現(xiàn)了一種由發(fā)酵乳酸桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素，可以對(duì)牛鏈球菌產(chǎn)生抑制作用[7]。此外，在牛鏈球菌中存在一個(gè)種間密度感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing，QS）LuxS/AI-2。LuxS信號(hào)系統(tǒng)以LuxS蛋白作為關(guān)鍵酶，合成信號(hào)分子自體誘導(dǎo)物-2（autoinducer-2，AI-2）。AI-2是一種呋喃硼酸二酯分子，介導(dǎo)不同細(xì)菌間相互交流。盡管在純化的培養(yǎng)基中LuxS基因的轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞密度不直接相關(guān)，但AI-2的活性可能對(duì)菌體的生理和代謝具有調(diào)節(jié)作用以使其適應(yīng)瘤胃條件的變化[8]。

牛鏈球菌產(chǎn)生的乳酸導(dǎo)致瘤胃pH值下降，使瘤胃內(nèi)大多數(shù)微生物生長受到抑制，從而使耐酸的乳酸桿菌占優(yōu)勢(shì)。目前，普遍認(rèn)為牛鏈球菌是一系列產(chǎn)酸反應(yīng)開始，并最終導(dǎo)致急性瘤胃酸中毒的發(fā)生。因此，牛鏈球菌被認(rèn)為是引發(fā)急性酸中毒的最主要的病原菌，目前主要的預(yù)防和治療措施如抗生素和疫苗的應(yīng)用也都是以控制瘤胃內(nèi)牛鏈球菌的生長為主要靶點(diǎn)。

1.1.3 乳酸桿菌

乳酸桿菌和鏈球菌相比耐酸性更強(qiáng)，這也是在酸中毒的瘤胃中（pH值＜5.6）乳酸桿菌占優(yōu)勢(shì)的主要原因。瘤胃內(nèi)乳酸桿菌數(shù)量顯著增加是急性和亞急性酸中毒共有的一個(gè)特征[9]。瘤胃同時(shí)擁有同型發(fā)酵（產(chǎn)物為L-和D-乳酸）和異型發(fā)酵（產(chǎn)物為乳酸、乙酸和乙醇）兩種類型的乳酸桿菌，由于瘤胃內(nèi)存在的乳酸桿菌種類繁多，所以通常很難在物種水平上對(duì)分離的菌株進(jìn)行鑒定，而是通常將其統(tǒng)稱為乳酸桿菌屬。Sharpe在采食谷物日糧為主的牛瘤胃內(nèi)分離鑒定了兩種主要的乳酸桿菌：瘤胃乳桿菌（L.ruminis）和犢乳桿菌（L.vitulinus），前者主要產(chǎn)生L（+）乳酸，而后者僅產(chǎn)生D（-）乳酸[10]。

1.1.4 其它淀粉分解菌

雙歧桿菌是革蘭氏陽性桿菌，可以從飼喂富含淀粉日糧的動(dòng)物瘤胃內(nèi)分離得到。雙歧桿菌不能利用淀粉，但其可促進(jìn)麥芽糖和葡萄糖的代謝。雙歧桿菌可以利用多種可溶性糖類，并且通過一種特殊途徑（果糖-6-磷酸途徑）來發(fā)酵葡萄糖，使其以摩爾比3∶2的比例生成乙酸和乳酸。丁酸弧菌是具有與革蘭氏陽性菌相似的細(xì)胞壁的革蘭氏陰性桿菌，它們?cè)诹鑫竷?nèi)細(xì)菌總數(shù)中占很大比例。盡管通常丁酸弧菌被人認(rèn)為是分解纖維素的主要細(xì)菌，但一些菌株具有淀粉酶活性，可以利用葡萄糖產(chǎn)生大量的乳酸[11]。溶淀粉琥珀酸單胞菌，是一種革蘭氏陰性桿菌，通常認(rèn)為其與淀粉消化有關(guān)，可以利用葡萄糖產(chǎn)生大量琥珀酸和少量乙酸以及蟻酸[12]。嗜淀粉瘤胃桿菌是一種革蘭氏陰性桿菌，是飼喂谷物類飼料動(dòng)物瘤胃內(nèi)分解淀粉的一類主要的細(xì)菌。然而，它對(duì)底物有一定的限制，僅能利用淀粉、淀粉糊精、麥芽糖，不能利用游離的葡萄糖，這可能是由于其不能轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖通過菌體壁膜間隙而造成的[13]。

1.2 乳酸利用菌

乳酸是瘤胃發(fā)酵的中間產(chǎn)物，可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)閂FA。瘤胃主要通過增加乳酸利用菌的數(shù)量來適應(yīng)高谷物類日糧。瘤胃內(nèi)可以發(fā)酵乳酸的細(xì)菌主要包括：埃氏巨型球菌（Megasphaera elsdenii）、反芻月形單胞菌乳酸分解亞種（Selenomonas ruminantium ssp.lactilytica）、解脂厭氧弧菌（Anaerovibrio lipolytica）、梭桿菌屬（Fusobacterium necrophorum）、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus asaccharolyticus）以及痤瘡丙酸桿菌（Propionibacterium acnes）和小韋榮球菌（Veillonella parvula）。在這些微生物中，埃氏巨球形菌和反芻月形單胞菌乳酸分解亞種是飼喂谷物飼料的動(dòng)物發(fā)酵乳酸的主要菌種[14]。

1.2.1 埃氏巨型球菌

埃氏巨型球菌是一種革蘭氏陰性大球菌，是瘤胃內(nèi)發(fā)酵乳酸的最重要的一種微生物。因此，它對(duì)防止采食谷物類飼料的動(dòng)物瘤胃內(nèi)乳酸堆積有著重要的作用。埃氏巨型球菌并不能利用淀粉，但其可以利用麥芽糖和葡萄糖，因此，他依賴于其它具有淀粉分解活性的細(xì)菌以獲得能量底物。埃氏巨型球菌可以發(fā)酵瘤胃內(nèi)約60%～80%的乳酸。埃氏巨型球菌的這種作用的主要原因可能是由于其具有一定程度的耐酸特性并且其對(duì)乳酸的發(fā)酵作用不受葡萄糖或麥芽糖等代謝產(chǎn)物的抑制。在體外純化培養(yǎng)條件下，埃氏巨型球菌直到乳酸被耗盡后才開始利用葡萄糖[15]。埃氏巨型球菌主要將乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜?、丙酸、丁酸及少量己酸和戊酸。L-乳酸通過轉(zhuǎn)變?yōu)楸┧岫罱K生成丙酸，而D-乳酸通過不依賴NAD的D-LDH而轉(zhuǎn)變?yōu)楸峄蛘咄ㄟ^乳酸消旋酶轉(zhuǎn)變?yōu)長-乳酸。D-乳酸產(chǎn)生的丙酮酸隨后代謝生成乙酸、丁酸、戊酸或己酸，并產(chǎn)生ATP。乳酸發(fā)酵產(chǎn)物的摩爾比例受葡萄糖水平和菌株差異的影響。在葡萄糖存在的條件下，丁酸、戊酸、己酸產(chǎn)量增加而同時(shí)丙酸產(chǎn)量下降[16]。埃氏巨型球菌可以利用乳酸產(chǎn)生丙酸，但并不能利用葡萄糖產(chǎn)生丙酸，主要原因可能是由于葡萄糖可以抑制其乳酸消旋酶的活性[17]。

1.2.2 反芻月形單胞菌乳酸分解亞種

反芻月形單胞菌乳酸分解亞種代謝乳酸主要生成琥珀酸和丙酸。盡管反芻月形單胞菌可以耐受低pH值，但反芻月形單胞菌乳酸分解亞種在酸性條件下生長速率較低。此外，反芻月形單胞菌乳酸分解亞種對(duì)乳酸的發(fā)酵可以被糖類抑制[18]。與埃氏巨型球菌相比反芻月形單胞菌利用乳酸的活性較差，主要是由于葡萄糖可以抑制其LDH的活性，但在埃氏巨型球菌并沒有這種現(xiàn)象[19]。

1.2.3 其它乳酸利用菌

小韋榮球菌，是一種革蘭氏陰性小球菌，其16S RNA序列與反芻月形單胞菌相近，可以發(fā)酵乳酸使其轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜岷捅?，但并不能發(fā)酵任何形式的糖類。解脂厭氧弧菌是一種能分解脂肪和甘油的微生物，主要與飼喂粗飼料或從粗料向精料轉(zhuǎn)變的動(dòng)物瘤胃內(nèi)的乳酸發(fā)酵有關(guān)，而對(duì)于已經(jīng)適應(yīng)了精料的動(dòng)物的乳酸發(fā)酵可能并沒有顯著作用[20]。1953年，Gutierrez利用乳酸培養(yǎng)基從瘤胃內(nèi)容物中分離得到了痤瘡丙酸桿菌[21]。Mackie等報(bào)道，厭氧弧菌屬和丙酸桿菌屬是采食高碳水化合物日糧的羊瘤胃內(nèi)主要的乳酸利用菌[22]。

2 瘤胃酸中毒與纖毛蟲

與細(xì)菌相似，瘤胃內(nèi)纖毛蟲的數(shù)量也隨著可利用底物的增加而增加。適當(dāng)增加碳水化合物的攝入可以導(dǎo)致纖毛蟲數(shù)量大幅度增加。而飼喂高濃度或完全碳水化合物日糧可以產(chǎn)生截然相反的結(jié)果，甚至導(dǎo)致某些動(dòng)物體內(nèi)纖毛蟲完全消失[23]。一般認(rèn)為，纖毛蟲對(duì)pH值的波動(dòng)和下降的變化要比細(xì)菌敏感，因此，瘤胃pH值是維持瘤胃內(nèi)纖毛蟲數(shù)量的關(guān)鍵因素。瘤胃內(nèi)纖毛蟲數(shù)量顯著減少，甚至在某些情況下完全消失，是急性和亞急性酸中毒共有的一個(gè)特征。瘤胃內(nèi)各種纖毛蟲中，內(nèi)纖毛蟲屬（Entodinium）、雙纖毛蟲屬多甲亞屬（Polyplastron）、均纖毛蟲屬（Isotricha）和密纖毛蟲屬（Dasytricha）等對(duì)低pH值均有一定的耐受能力[24]。內(nèi)纖毛蟲屬是瘤胃內(nèi)原蟲中對(duì)低pH值耐受能力最強(qiáng)的，這也是其在瘤胃內(nèi)的數(shù)量最多的原因，在飼喂高碳水化合物日糧的牛瘤胃內(nèi)大約占總數(shù)的90%～99%[25]。

纖毛蟲對(duì)瘤胃內(nèi)淀粉和乳酸代謝有著重要的作用。就乳酸產(chǎn)生來說，均纖毛蟲屬和密纖毛蟲屬可以發(fā)酵淀粉或糖類產(chǎn)生兩種形式的乳酸，而內(nèi)纖毛蟲屬產(chǎn)生乳酸的量卻很少[26]。在另一方面，乳酸發(fā)酵主要與內(nèi)纖毛蟲屬有關(guān)而與均纖毛蟲屬無關(guān)。盡管纖毛蟲對(duì)于瘤胃內(nèi)乳酸產(chǎn)量及其代謝的作用尚不清楚，但目前普遍認(rèn)為纖毛蟲的數(shù)量與瘤胃內(nèi)乳酸濃度呈負(fù)相關(guān)。這可能是由于纖毛蟲可以吸收淀粉和糖類，從而使其避免了被細(xì)菌發(fā)酵而引起的。更為重要的是，由于其與細(xì)菌間的相互作用，纖毛蟲還可能對(duì)乳酸的產(chǎn)生和蓄積有著間接的影響，主要是由于其捕食活性可以導(dǎo)致瘤胃內(nèi)細(xì)菌密度下降。因此，纖毛蟲在一定程度上可以降低瘤胃內(nèi)淀粉發(fā)酵速率。而淀粉發(fā)酵緩慢導(dǎo)致VFA產(chǎn)量穩(wěn)定以及采食后瘤胃內(nèi)pH值升高。細(xì)菌活力下降說明在飼喂高谷物日糧的動(dòng)物中纖毛蟲對(duì)瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生了緩慢的影響。因此，對(duì)于飼喂谷物類飼料的牛來說，纖毛蟲具有一定的緩沖效應(yīng)。但事實(shí)卻恰恰相反，纖毛蟲對(duì)于飼喂高谷物日糧的牛的瘤胃代謝所產(chǎn)生的作用并不顯著，因?yàn)榈矸蹫橹鞯娜占Z可以顯著減少甚至清除瘤胃內(nèi)的纖毛蟲種群。

3 展望

盡管許多研究人員多年以來一直致力于研究瘤胃酸中毒中微生物的變化，但對(duì)于瘤胃pH值波動(dòng)引發(fā)的微生物變化的認(rèn)識(shí)仍然存在較大分歧。目前，研究瘤胃內(nèi)微生物區(qū)系特別是細(xì)菌和真菌的方法還是依賴于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法有著一定的局限性，主要是因?yàn)槠洳荒苋娣治稣麄€(gè)生態(tài)系統(tǒng)之間的關(guān)系。同樣，盡管核酸技術(shù)在評(píng)價(jià)和監(jiān)測(cè)瘤胃內(nèi)微生物變化方面更敏感、精確，可以準(zhǔn)確鑒定含量較少的細(xì)菌，但對(duì)其具體功能的研究尚存在一定的局限性。因此，瘤胃酸中毒的研究必須致力于應(yīng)用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)和其它菌體分離和定量的技術(shù)，進(jìn)一步鑒定各菌種的功能及相互關(guān)系，確定瘤胃內(nèi)各類細(xì)菌對(duì)瘤胃酸中毒的具體作用。