綠茶提取物EGCG對(duì)實(shí)驗(yàn)性口腔鱗癌移植瘤淋巴管形成的影響

陳秀蘭

(咸寧市中心醫(yī)院口腔科，湖北咸寧437100)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是頭頸部常見的惡性腫瘤，其惡性度高、侵襲性強(qiáng)，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究表明，約50%的患者在診斷為口腔鱗癌時(shí)已經(jīng)發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［1］。口腔鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移直接影響臨床治療方式和頸部淋巴結(jié)清掃的范圍，是導(dǎo)致其預(yù)后差，5年生存率低的主要原因。研究證實(shí):腫瘤轉(zhuǎn)移的過程不僅僅是原有淋巴結(jié)被動(dòng)接受瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的過程［2］，還包括腫瘤和區(qū)域性淋巴結(jié)尤其是前哨淋巴結(jié)周圍新生淋巴管形成的過程［3］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子－C(vascular endothelial growth factor－C，VEGF－C)在新生淋巴管形成方面起了主要作用。本實(shí)驗(yàn)的目的就是研究綠茶提取物茶多酚中的主要活性物質(zhì)表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin－3－gallate，EGCG)對(duì)實(shí)驗(yàn)性口腔鱗癌移植瘤表達(dá)VEGF－C的影響，探討EGCG靶向抑制口腔鱗癌淋巴管形成的可行性及相關(guān)機(jī)制，期望為今后新藥開發(fā)、臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取24只5周齡的BALB/c裸鼠，雌雄對(duì)半。細(xì)胞株:人舌癌細(xì)胞株Tca8113購于湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑及配制方法

EGCG用RPMI 1640培養(yǎng)液配制成0.1%的母液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌后于4℃避光保存，使用前按設(shè)定濃度用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋后使用。RPMI 1640培養(yǎng)液購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司。兔抗人VEGF－C多克隆抗體(LOP－1516)購自上海工碩生物技術(shù)有限公司，鼠抗人D2－40單克隆抗體(DM－004)購自上海億欣生物科技有限公司。SP免疫組化試劑盒購自福州邁新生物有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人舌癌細(xì)胞株Tca8113用含有10%胎牛血清，100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃，含5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3d換液傳代。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

選取24只5周齡的BALB/c裸鼠，皮下注射口腔鱗癌細(xì)胞株7d后，隨機(jī)分成3組，分別喂食含有0(1組)、0.01%(2組)、0.1%(3組)EGCG的自來水35d。

1.5 石蠟組織切片的制備

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用頸椎脫臼法處死裸鼠。小心剝離移植瘤，置于10%中性多聚甲醛溶液中固定24h，梯度酒精脫水、二甲苯透明后，石蠟包埋。經(jīng)組織切片機(jī)切片、攤片、撈片、烤片后制成厚度為5μm的組織切片備用。同一蠟塊采取連續(xù)切片，一部分用于檢測(cè)VEGF－C的表達(dá)，另一部分用于檢測(cè)微淋巴管密度。

1.6 免疫組化法檢測(cè)VEGF－C的表達(dá)

采用免疫組化SP法，按試劑盒說明書進(jìn)行染色，以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。即切片脫蠟至水后，經(jīng)內(nèi)源性過氧化物酶滅活、抗原修復(fù)、血清封閉、兔抗人VEGF－C多克隆抗體(一抗)4℃過夜，辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(二抗)37℃ 30min孵育后，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，DAB/H2O2反應(yīng)染色。蘇木素復(fù)染、常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選至少6個(gè)觀測(cè)區(qū)，用400倍視野進(jìn)行拍照(盡量讓組織充滿整個(gè)視野)。應(yīng)用Image－Pro Plus 6.0軟件對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出每張照片的陽性細(xì)胞累積光密度值(integrated optical density，IOD)。每組照片的平均值代表該組的IOD值。

1.7 免疫組化法檢測(cè)微淋巴管密度(lymphatic micovessel density，LMVD)

方法同上，只是一抗為鼠抗人D2－40單克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體。D2－40標(biāo)記微淋巴管密度(LMVD)判定［4］方法:在低倍鏡下(×100)選取脈管數(shù)目最多的兩個(gè)區(qū)域，即“熱點(diǎn)”(hot spots)，然后在高倍鏡下(×400)觀察每個(gè)熱點(diǎn)中的5個(gè)視野，計(jì)數(shù)其中脈管數(shù)，但應(yīng)忽略管腔直徑＞8個(gè)紅細(xì)胞或管壁有平滑肌存在的脈管，最后計(jì)算2個(gè)熱點(diǎn)、5個(gè)視野的平均脈管數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 12.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 VEGF－C 的表達(dá)

VEGF－C的陽性染色為棕黃色，表達(dá)在移植瘤癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)，為局灶性或彌散性分布。1、2、3組的 IOD分別為:7983.16±1024.41、5372±879.63、2461.43±794.62。組間均數(shù)的比較顯示差異具有顯著性。

2.2 LMVD計(jì)數(shù)

D2－40特異性地表達(dá)在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕黃色顆粒。血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中未見表達(dá)。1、2、3組的 LMVD計(jì)數(shù)分別為:12.64±2.73、8.13±2.01、5.37 ±1.16。組間均數(shù)的比較顯示差異具有顯著性。

3 討論

VEGF－C是VEGF家族新成員，主要介導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和趨化。已有研究證實(shí)VEGFC/VEGFR－3在口腔鱗癌中存在異常表達(dá)，其表達(dá)水平與微淋巴管密度明確相關(guān)［5］。EGCG是綠茶提取物茶多酚中的主要活性物質(zhì)，MTT、吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)熒光雙染色、DNA瓊脂糖凝膠電泳等實(shí)驗(yàn)表明EGCG對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞株Tca8113有明顯的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡作用，并存在濃度、時(shí)間依賴性［6］，但機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化法研究EGCG對(duì)實(shí)驗(yàn)性口腔鱗癌移植瘤VEGF－C表達(dá)的影響和對(duì)微淋巴管密度的影響，結(jié)果表明:EGCG能明顯抑制移植瘤中VEGF－C的表達(dá)，顯著減少微淋巴管的密度，并存在濃度依賴性。提示EGCG通過特異性地下調(diào)VEGF－C的表達(dá)，阻斷新生淋巴管的形成，從而降低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，提高5年生存率。這一結(jié)論雖不能提示飲用綠茶可以直接治療舌癌(飲用所攝入的劑量不足以達(dá)到實(shí)驗(yàn)中提示的有效量)，但是仍揭示了EGCG作為潛在的腫瘤實(shí)驗(yàn)性治療藥物的應(yīng)用價(jià)值。

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