斷奶仔豬腸道屏障功能的研究進(jìn)展

■徐建雄 盛永帥

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

小腸上皮細(xì)胞主要有3個(gè)功能：消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)；分泌、吸收水分和電解質(zhì)以維持腸腔內(nèi)適宜的黏稠度，排出有害物質(zhì)；抵擋各種毒素及病原微生物。腸道屏障功能損傷導(dǎo)致腸道黏膜通透性增加會(huì)加劇細(xì)菌或有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體，進(jìn)而引起免疫反應(yīng)，增加發(fā)病率[1-2]。

在大鼠和人類的試驗(yàn)中已證實(shí)，各種內(nèi)源性或外源性應(yīng)激都會(huì)導(dǎo)致小腸屏障功能損傷[3-4]。在畜牧生產(chǎn)中，仔豬早期斷奶常常伴隨著心理、環(huán)境和營養(yǎng)三大應(yīng)激[5]。仔豬斷奶后血漿中皮質(zhì)醇和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子濃度上升證實(shí)了斷奶應(yīng)激的存在。斷奶后大多數(shù)仔豬的采食量較低，約10%的仔豬在斷奶后48 h內(nèi)不攝取任何飼料[6]。斷奶后低采食量會(huì)引起小腸絨毛萎縮、脫落、腸絨毛隱窩增加[7-9]。斷奶仔豬極易遭受感染[7]，引發(fā)水腫病，這與斷奶造成的腸道屏障功能損傷密切相關(guān)[10]。斷奶后腸組織形態(tài)學(xué)變化，抗病能力下降和水腫病的出現(xiàn)都表明腸道屏障功能受到損傷。本文介紹了腸道屏障功能的評(píng)估方法，綜述了仔豬旁細(xì)胞屏障及跨細(xì)胞屏障的影響因素，以及緩解小腸屏障功能損傷的方法。

1 小腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)

小腸上皮轉(zhuǎn)運(yùn)途徑可分為旁細(xì)胞途徑和跨細(xì)胞途徑。旁細(xì)胞途徑是指腸腔內(nèi)物質(zhì)通過腸上皮細(xì)胞之間的緊密連接進(jìn)入細(xì)胞外間隙的過程。緊密連接是一種蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，連接腸上皮細(xì)胞、密封細(xì)胞間隙[11]。它是一種動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)，除有機(jī)械連接作用外，更重要的是封閉細(xì)胞頂部的細(xì)胞間隙，并將表皮與內(nèi)皮細(xì)胞的頂端和基底液體腔室分割開來，阻擋細(xì)胞外的大分子物質(zhì)經(jīng)細(xì)胞間隙進(jìn)入組織內(nèi)，發(fā)揮滲透性調(diào)節(jié)功能，調(diào)節(jié)離子與蛋白透過性[12]?？缂?xì)胞途徑是指腸腔內(nèi)物質(zhì)經(jīng)腸上皮細(xì)胞頂端膜進(jìn)入細(xì)胞，再由細(xì)胞基底側(cè)膜排入細(xì)胞外間隙的過程。包括通過主動(dòng)及被動(dòng)吸收小分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，通過胞吞吸收大分子物質(zhì)。仔豬出生后通過胞吞作用吸收母乳免疫球蛋白和攝取抗原對(duì)其健康極其重要。

2 腸道屏障功能的評(píng)估方法

2.1 尤斯灌流室法

尤斯灌流室法(Ussing chamber)是體外評(píng)估腸道屏障功能的常用方法。通過微電極檢測(cè)細(xì)胞膜離子通道變化的電流信號(hào)，來反映腸道養(yǎng)分、藥物吸收、通透性和分泌情況的變化。采用尤斯灌流室法主要可以測(cè)得三項(xiàng)電生理參數(shù)：①腸黏膜的跨上皮細(xì)胞電阻（TEER），反映上皮細(xì)胞間緊密連接的開放程度，即腸黏膜旁細(xì)胞途徑的通透性[13]。TEER增加則代表細(xì)胞通透性降低，反之則提高。②跨膜電導(dǎo)，為TEER倒數(shù)[13]。③短直路電流(Isc)，衡量通過黏膜正離子數(shù)量的參數(shù)。

2.2 分子探針檢測(cè)方法

醫(yī)學(xué)研究中通過體內(nèi)滲透試驗(yàn)來評(píng)估腸道通透性已有數(shù)十年[14]?？诜C(jī)體無法代謝的物質(zhì)（探針），經(jīng)腸上皮細(xì)胞吸收后，通過收集尿液或血液檢測(cè)腸道通透性。最常用的探針是一些特殊的單糖或雙糖如D-木糖[8，15-19]。它們不能被消化酶降解，難以在體內(nèi)代謝，僅能由結(jié)腸中的細(xì)菌發(fā)酵[20]，而且糖幾乎只由小腸吸收，對(duì)消化和代謝的影響最小。因此，它們可作為測(cè)定小腸通透性、特異性的標(biāo)志物[20]。

分子探針檢測(cè)方法可不處死仔豬就能測(cè)定腸屏障功能，對(duì)同一仔豬可重復(fù)測(cè)量，也可以測(cè)定不同健康狀態(tài)下小腸的屏障功能。這相對(duì)尤斯灌流室法有明顯的優(yōu)勢(shì)。但尤斯灌流室法可以對(duì)腸道特定部位的滲透率進(jìn)行評(píng)估，因此這兩種方法具有互補(bǔ)性。

一些學(xué)者用尤斯灌流室法對(duì)仔豬的腸屏障功能進(jìn)行了監(jiān)測(cè)和評(píng)估。用甘露醇和TEER評(píng)估旁細(xì)胞途徑的屏障功能，用辣根過氧化物酶(HRP)評(píng)估有關(guān)跨細(xì)胞途徑的屏障功能。甘露醇的分子質(zhì)量為182 Da，它主要通過旁細(xì)胞途徑透過黏膜層[20-21]，但也不能排除跨細(xì)胞途徑。HRP是分子質(zhì)量為40 kDa蛋白質(zhì)，具有酶的活性，因此，極低濃度的HRP也能夠被檢測(cè)出來，它在小腸跨膜運(yùn)輸中是一種非常靈敏的檢測(cè)物質(zhì)。HRP主要是通過胞吞作用[22-23]透過腸黏膜上皮細(xì)胞。黏膜屏障功能受損時(shí)細(xì)胞胞吞作用加強(qiáng)，其吸收作用增加[23]，同時(shí)HRP也可透過通透性的增加緊密連接進(jìn)入機(jī)體[22]。

3 斷奶對(duì)細(xì)胞途徑的影響

3.1 對(duì)跨細(xì)胞途徑的影響

Boudry和Verdonk發(fā)現(xiàn)，與斷奶前相比，在斷奶后第2、5、15 d[24]以及第4、7 d[25]空腸前段HRP通透性下降。這可能是由于斷奶加快了小腸自然成熟的過程，降低胞吞和大分子物質(zhì)通過的速率。小腸成熟可以防止動(dòng)物吸收過多抗原物質(zhì)，而抗原吸收過多會(huì)引起仔豬免疫系統(tǒng)過度激活，進(jìn)而影響仔豬健康。斷奶后腸道會(huì)經(jīng)歷一次成熟過程，腸道成熟的實(shí)質(zhì)是成熟的腸細(xì)胞替代原有細(xì)胞，這一過程涉及到細(xì)胞的增殖、凋亡和壞死。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，21日齡斷奶仔豬腸細(xì)胞凋亡顯著增加，內(nèi)源性和外源性的凋亡途徑同時(shí)被激活，斷奶加速了小腸的成熟過程[26]。有研究表明，仔豬斷奶后35 d時(shí)HRP通透性相對(duì)于斷奶后15 d時(shí)下降了90%[24]，也支持了以上推論。van der Meulen等研究發(fā)現(xiàn)，與斷奶后1 d相比，空腸中段的HRP通透性在斷奶4 d和7 d后增加[27]。但此研究并沒有測(cè)定斷奶前HRP的通透性（第1次測(cè)量為斷奶后1 d），試驗(yàn)仔豬被運(yùn)輸、隔離，禁食過夜后才進(jìn)行尤斯灌流室測(cè)定。因此，試驗(yàn)前處理造成了應(yīng)激，使得其結(jié)果與Boudry等和Verdonk等的結(jié)果相矛盾[24-25]。已有研究證明，應(yīng)激能增加大鼠小腸HRP通透性[28]。因此，van der Meulen等的試驗(yàn)中HRP通透性的增加是由除了斷奶應(yīng)激之外的試驗(yàn)應(yīng)激引起的[27]。與空腸不同，回腸中HRP通透性不受斷奶的影響[24]。其可能原因是回腸HRP通透性相對(duì)較低（僅為空腸的35%），斷奶時(shí)，回腸中抗原吸收量已處在較低的水平，進(jìn)一步減少攝入量并無益處。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，斷奶后空腸前段HRP通透性不受營養(yǎng)水平的影響[25]，而空腸中段，其通透性也不受斷奶日齡(4周或7周)及營養(yǎng)水平的影響[25，27]。將25 kg仔豬(斷奶后4～6周)的基礎(chǔ)日糧從代乳粉轉(zhuǎn)變?yōu)榇篼溁蛐←溔占Z，4 d后，仔豬空腸前段HRP通透性與飼喂代乳粉組相比無差異[29]。同時(shí)，25日齡斷奶仔豬斷奶后日糧中添加色氨酸(5 g/kg)，在斷奶后4、5、6 d后小腸中段的HRP通透性沒有變化[30]，產(chǎn)毒性大腸桿菌感染對(duì)3周齡仔豬空腸前段HRP通透性沒有影響[31]。Boudry等報(bào)道，肥大細(xì)胞脫顆粒（應(yīng)激來源之一，提高通透性）對(duì)哺乳仔豬回腸HRP通透性的影響隨年齡增大而下降[32]。與此同時(shí)，R?dberg等發(fā)現(xiàn)，2周齡的哺乳仔豬飼喂紅蕓豆凝集素會(huì)降低小腸對(duì)大分子（牛血清白蛋白，45 kDa；卵清蛋白，67 kDa）的通透性[33]。由上可知，常規(guī)日糧不影響斷奶后HRP通透性，但特定的營養(yǎng)物質(zhì)可以減少小腸對(duì)大分子的通透性，斷奶前抗原的攝取水平高于斷奶后。這進(jìn)一步支持?jǐn)嗄毯罂乖臄z取隨著時(shí)間的推移而降低是受小腸成熟過程影響的假設(shè)。

3.2 對(duì)旁細(xì)胞途徑的影響

Moeser等研究表明，與未斷奶組仔豬相比，28日齡斷奶仔豬斷奶后1 d，空腸中段甘露醇通透性和TEER無差異[34]；而Hu等發(fā)現(xiàn)，21日齡斷奶仔豬斷奶后第3、7、14 d，與斷奶時(shí)相比空腸黏膜緊密連接蛋白 mRNA 表達(dá)降低[35]；Moeser[34，36]和 Boudry等[24]研究表明，3周齡斷奶仔豬斷奶后第1 d和第2 d，與正在斷奶或未斷奶的對(duì)照組相比，空腸前段和中段甘露醇通透性明顯增加，TEER顯著減小，表明高齡斷奶可以有效防止斷奶后的上皮旁細(xì)胞運(yùn)輸屏障功能的損傷。此外，Moeser等發(fā)現(xiàn)，對(duì)于3周齡仔豬，當(dāng)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體拮抗劑或肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑阻斷應(yīng)激通路后，TEER和甘露醇通透性則不受斷奶影響[34，36]，說明應(yīng)激是仔豬斷奶后腸道屏障功能紊亂的主要因素，免疫系統(tǒng)激活肥大細(xì)胞對(duì)仔豬斷奶后腸道屏障功能的損傷有重要影響。但也有一些研究發(fā)現(xiàn)，26日齡斷奶仔豬腸屏障功能也會(huì)受損[25,37-39]。

Verdonk測(cè)定以代乳品為日糧的斷奶仔豬空腸中段甘露醇通透性，發(fā)現(xiàn)高采食量仔豬斷奶后1、2、4 d時(shí)甘露醇通透性與斷奶前無差異，而低采食量仔豬甘露醇通透性在斷奶后2、4 d時(shí)較斷奶前增加。通過比較斷奶后1、2、4 d的平均結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低采食量仔豬較高采食量仔豬甘露醇通透性更高[39]。同時(shí)，23日齡仔豬禁食2 d后會(huì)降低TEER[40]。因此，斷奶后充足的采食能有效防止緊密連接屏障功能損傷，表明充足的腸腔營養(yǎng)供應(yīng)對(duì)維持屏障功能的重要性。充足的采食量對(duì)小腸前段更加重要，小腸前段較末段更依賴腸腔營養(yǎng)[41]。仔豬斷奶后低采食量個(gè)體小腸前段絨毛高度降低，高采食量仔豬則幾乎無影響[39]，說明高采食量仔豬腸腔營養(yǎng)供應(yīng)更充分。Spreeuwenberg等[38]也發(fā)現(xiàn)，斷奶后小腸中段甘露醇通透性增加。Verdonk等[25，39]在另外兩個(gè)研究中測(cè)定斷奶仔豬空腸前段上皮細(xì)胞甘露醇通透性。第一個(gè)試驗(yàn)中，斷奶第2 d和第6 d甘露醇通透性較斷奶前升高。然而，第二個(gè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，斷奶后第4 d和第7 d甘露醇通透性與斷奶前相比無差別，且不受斷奶后采食量水平的影響。Verdonk后一個(gè)試驗(yàn)與其前兩項(xiàng)研究[25，39]和 Spreeuwenberg等的研究相比[38]，盡管斷奶后飼料攝入量很低，但小腸對(duì)甘露醇的通透性并沒有增加，可能與試驗(yàn)仔豬的前處理不同有關(guān)。在Verdonk的前兩項(xiàng)和Spreeuwenberg等的研究中[38]，試驗(yàn)前仔豬經(jīng)歷了運(yùn)輸過程。而Verdonk的最后試驗(yàn)中[39]，仔豬是在同一個(gè)地方進(jìn)行斷奶和試驗(yàn)，因而減少了應(yīng)激。由于應(yīng)激對(duì)腸屏障功能損傷有重要影響，這或許是造成研究結(jié)果不同的原因。Lodemann等發(fā)現(xiàn)，斷奶后7 d仔豬空腸中段甘露醇通透性顯著低于斷奶前，而TEER與斷奶前相比則無差異[42-43]，可能由于測(cè)定時(shí)間較遲造成的；同時(shí)，此試驗(yàn)斷奶應(yīng)激水平可能低于其他試驗(yàn)?；啬cTEER在斷奶后第5 d和第15 d比斷奶前顯著增加[24]。Carlson等通過對(duì)4周齡斷奶仔豬回腸研究也得到類似結(jié)論。他們發(fā)現(xiàn)，跨膜電導(dǎo)率（TEER倒數(shù)）在斷奶后1～2 d與斷奶前無差異，而斷奶后5～6 d和14～15 d則低于斷奶前[44]。因此，相較于空腸前段和中段，回腸屏障功能不受斷奶過程影響。Berkeveld等[19]分別在斷奶前、斷奶后0.5、2、4、7 d飼喂仔豬一定劑量的甘露醇，并在1 h后測(cè)定血漿中甘露醇濃度，發(fā)現(xiàn)血漿中甘露醇濃度隨斷奶時(shí)間逐漸降低，斷奶前和斷奶4 d時(shí)的濃度顯著不同。Berkeveld等的研究[19]反映了甘露醇在整個(gè)小腸的通透性，而血漿中甘露醇濃度易受多種因素影響，如胃排空率、腸道吸收率和血液的清除率[45]。Berkeveld等[19]的試驗(yàn)結(jié)果（飼喂甘露醇）與其它研究結(jié)果（尤斯灌流室法）相矛盾的原因可能與檢測(cè)腸道甘露醇通透性的技術(shù)不同有關(guān)。

通常，通過飼料預(yù)防仔豬斷奶后腸道旁細(xì)胞屏障損傷的效果較小。在母豬和仔豬日糧補(bǔ)充不同的益生菌對(duì)仔豬斷奶后空腸中段甘露醇通透性和TEER沒有影響[42-43]。在Carlson等的研究中，斷奶后5～7 d后銅和鋅水平對(duì)空腸和回腸的跨膜電導(dǎo)率無影響[44，46]。然而，在 Zhang等的研究中發(fā)現(xiàn)[47]，斷奶后飼喂2周高濃度鋅日糧會(huì)使尿液中乳果糖∶甘露醇比值下降。Carlson等與Zhang等的研究差異可能由研究過程中應(yīng)激水平的不同造成。在Zhang等的研究中，參試仔豬在試驗(yàn)之前被隔離單獨(dú)飼養(yǎng)并禁食過夜，增加了應(yīng)激水平。將25 kg仔豬的日糧由代乳品轉(zhuǎn)換為以大麥或小麥為基礎(chǔ)的日糧，4 d后空腸TEER與代乳品飼喂組相比無差異，而增加日糧中乳糖濃度（41%∶24%）和減少日糧中的蛋白質(zhì)濃度（15%∶30%）則會(huì)引起小腸中段甘露醇通透性下降[38]。但試驗(yàn)并不能確定乳糖或蛋白質(zhì)單獨(dú)對(duì)甘露醇通透性的影響。在同一研究中，降低日糧中乳糖濃度(8%∶24%)和增加日糧中蛋白質(zhì)濃度(45%∶30%)對(duì)甘露醇通透性沒有影響。Hamard等發(fā)現(xiàn)，7日齡斷奶仔豬飼喂兩周蘇氨酸缺乏日糧后，回腸對(duì)異硫氰酸熒光素右旋糖酐(4 kDa)通透性增加，TEER也呈下降趨勢(shì)[48]；Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，仔豬日糧添加精氨酸可有效阻止脂多糖應(yīng)激導(dǎo)致的腸道損傷，促進(jìn)腸黏膜損傷的修復(fù)[49]。上述研究表明，常規(guī)日糧組成對(duì)旁細(xì)胞屏障無重大影響，而當(dāng)日糧中缺乏特定的營養(yǎng)物質(zhì)（如蘇氨酸）時(shí)旁細(xì)胞屏障會(huì)損傷。同時(shí)，低采食量也會(huì)使腸屏障功能受損。此外，當(dāng)試驗(yàn)過程伴有其它應(yīng)激時(shí)（如禁食和單獨(dú)飼養(yǎng)）旁細(xì)胞屏障也會(huì)受到影響。

小腸屏障功能受斷奶過程的影響，斷奶日齡、斷奶應(yīng)激、采食量和日糧組成等因素對(duì)斷奶仔豬腸道屏障功能產(chǎn)生重大影響。斷奶過程對(duì)仔豬空腸前段和中段腸道屏障功能影響較強(qiáng)，而對(duì)回腸影響較弱。斷奶應(yīng)激激活免疫系統(tǒng)和肥大細(xì)胞，這對(duì)小腸緊密連接屏障功能損傷有重要影響。低采食量是斷奶后屏障功能損失的又一重要因素，充足的采食量可以防止旁細(xì)胞屏障功能損傷及絨毛高度降低。由于腸道養(yǎng)分供應(yīng)對(duì)前段小腸最為關(guān)鍵，與空腸前段和后段不同，斷奶后回腸的旁細(xì)胞屏障功能并沒有減弱，說明斷奶后由采食不足引起的屏障功能損傷是由于腸腔營養(yǎng)供應(yīng)不足造成的。也有試驗(yàn)證明，仔豬飼喂2周蘇氨酸缺乏日糧會(huì)引起小腸屏障功能受損。這種由養(yǎng)分供應(yīng)導(dǎo)致的屏障功能損傷，可能間接由小腸結(jié)構(gòu)損傷引起。旁細(xì)胞屏障功能損傷一般只出現(xiàn)在斷奶第1周內(nèi)，2周后就恢復(fù)到斷奶前水平。高日齡斷奶可以防止腸屏障功能損傷[34,50]，這可能由于早期斷奶仔豬腸道處于發(fā)育早期，腸道功能尚未完善。此外，跨細(xì)胞屏障功能在斷奶后加強(qiáng)，大分子通過胞吞作用進(jìn)入體內(nèi)減少，說明小腸成熟過程可以防止仔豬抗原攝入過量，而斷奶仔豬在新環(huán)境下，抗原攝入過量可能會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)過度激活。

由上可知，3種方法可以預(yù)防斷奶仔豬腸屏障功能損傷：第一，改善飼料適口性，增加采食量，這種方法已取得一定成效；第二，確定關(guān)鍵的營養(yǎng)物質(zhì)（如蛋白質(zhì)或特定氨基酸），對(duì)低采食量仔豬以高濃度添加到飼料或飲水中以防止腸道屏障功能損傷；第三，添加特定生物活性成分以調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)和免疫反應(yīng)。