表皮生長因子及其作用機制

胡瑩瑩，王 琦，陳 瑛

(哈爾濱師范大學)

0 引言

1962年，Cohen.S用羧甲基纖維素從雄性小鼠頜下腺腺管分離出純化神經生長因子(NGF)后發(fā)現另一類物質可使新生小鼠眼瞼早開、牙齒早萌、體重減輕和毛發(fā)生長延遲，他提純了這種由53個氨基酸構成的單鏈多肽稱之為表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)［1-3］.

1979年，Carpenter等人報道了人表皮生長因子(hEGF)的氨基酸殘基組成［4］.同年，Gregory從人尿中發(fā)現了能夠抑制胃酸分泌的抑胃素，稱之為尿抑胃素(Urogastrone，UG)，并發(fā)現EGF與UG的化學結構與生物活性極為相似，于是人們把EGF和UG這兩種多肽看成同一物質，一般稱之為上皮生長因子—尿抑胃素(EGF—UG)［5］.隨后，在大白鼠、豬等生物體中均發(fā)現了表皮生長因子mEGF和pEGF.

這之后關于EGF的生物學功能開展了大量研究.經研究發(fā)現EGF具有促進細胞分裂、與某些癌性病變密不可分，除此之外，對呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)也有很重要的作用.尤其是EGF可以促進上皮細胞分裂增殖，Imanish J，Kamiyama K Iguchi等人在2000年發(fā)現應用EGF可以明顯增加創(chuàng)面的內膠原和細胞DNA含量，加速創(chuàng)面愈合.隨后EGF不論在臨床應用還是美容領域都得到廣泛應用.

近年來，對 EGF及其受體(EGF receptor，EGFR)的研究成為生物化學研究的熱點之一，對于其作用機制、影響因子和如何提高其生物學功能進行了廣泛的研究.

1 表皮生長因子家族、分子結構及其生物學效應

1.1 表皮生長因子家族

在發(fā)現EGF后的40多年時間里，又先后發(fā)現了一些與EGF密切相關的生長因子，大小都在50～80個氨基酸之間，被稱為EGF家族.包括1976年Todaro和Delareo在肉瘤病毒轉化的3T3成纖維細胞培養(yǎng)介質中發(fā)現一種具有EGF活性的生長因子，命名為轉化生長因子 α［6］(transforming growth factor α，TGF α)、之后又發(fā)現了牛痘病毒生長因子［7］(vaccinia growth factor，VGF)、休普氏纖維瘤生長因子［8］(shope fibroma growth factor，MGF)、粘液瘤生長因子［9］(myxoma growthfactor，MGF)、兩性調節(jié)蛋白［10］(ampiregulin)、雙向調節(jié)素(arnphireguli，AR)、betacellulin(BTC)、epiregulin(EPl)、結合肝素的EGF樣生長因子(heparin-bingingEGF-likeg-rowth factor，HB-EGF)、痘苗病毒生長因子(vaccinia virus growth factor，VVGF)等.

1.2 表皮生長因子的分子結構特點

EGF是最早確立結構的生長因子.1986年Bell等人通過基因克隆及重組分析，闡明了EGF的基因位點及其編碼序列，小鼠和人的EGF基因均為單拷貝基因.編碼小鼠和人EGF的基因分別位于第3號和第4號染色體的長臂上［11］.hEGF以hEGF-β和 hEGF-γ兩種形式存在，hEGF-β和hEGF-γ兩者有98%的同源性和相似的分子結構，而且它們作用于同一個受體，并產生相同的生物學效應.

EGF的mRNA序列由4871bp組成，編碼一個1217個氨基酸殘基的大分子蛋白前體，有一個長3621bp的開放閱讀框，編碼1207個氨基酸殘基.EGF前體有兩個類似疏水袋的序列，一個位于前體的N末端，作為生物合成時的信號肽，在轉錄后很快被除去;另一個在前體的C端附近的成熟EGF序列之后，由于這一疏水序列后又跟有一個含大量堿性氨基酸的短序列，因而這段序列可能是固定在膜上的跨膜蛋白，類似于一個跨膜受體，被廣泛的認為EGF就是在膜表面通過蛋白酶水解后由前體加工而來.hEGF前體除具有產生成熟hEGF外，其可能本身也具有生物活性，如hEGF分子的C結構域可能與受體結合來刺激細胞增殖，也有人推測它可能作為一種膜蛋白，在離子轉運及細胞識別中起識別作用［12］.

EGF家族的成員在一級結構上相差甚大，有30%的同源性，但在空間結構上具有一定的保守性［13］，EGF家族內存在著11個保守的氨基酸殘基，其中完全保守的6個半胱氨酸殘基，在分子內部形成3對二硫鍵，使得這些分子具有相似的空間構象，因而都能夠與EGF受體結合，并且在生物學的功能上也表現出一定的相似性［14］，因此把它們歸為一個家族，稱為EGF家族.EGF家族的結構特征可以從兩方面來認識:一是它的一級結構，從中人們發(fā)現了多種吸引廣大學者的序列;二是它的空間結構，借助高分辨率的核磁共振(NMR)分析技術［15］已對EGF的空間構象有了更深刻的了解和認識.

成熟的hEGF是具有53個氨基酸殘基的不可透析的單鏈多肽，等電點(PI)為4.6，分子量為6045Da，對熱穩(wěn)定，含 3 個鏈內二硫鍵［16］，從而在6～20、14～3l和33～42之間分別形成三個環(huán)，這些環(huán)狀結構使EGF對蛋白酶具有較高的穩(wěn)定性，活性中心位于48～53個氨基酸殘基之間，該二硫鍵對EGF生物學活性的發(fā)揮起重要作用［17］.

成熟的小鼠表皮生長因子(mEGF)是一種水溶性、低分子量、對酸對熱穩(wěn)定、不可透析的單鏈多肽，由53個氨基酸組成，不含丙氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸，含有3個鏈內二硫鍵，分子量約為6040Da，等電點為4.6，消光系數(280nm)為30.9，沉淀常數 1.25s［18］.早期圓二色譜分析表明，mEGF的二級結構是致密的球狀結構，其中約25%為β-片層結構，75%為無規(guī)則的螺旋卷曲，無α-螺旋.后經核磁共振(NMR)研究證實其肽骨架中僅存在反平行的 β-片層［19-20］.mEGF在鹽酸胍中的伸展動力學研究表明，mEGF是已知的最穩(wěn)定的蛋白之一.

EGF對熱穩(wěn)定，在-20℃中能保持長期穩(wěn)定;在中性溶液中100℃煮沸30 min仍保持穩(wěn)定，但在100℃的0.1NNaOH或0.2NHCI中失活.耐胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶的消化.EGF分子中不含丙氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸.第53位精氨酸和第52位亮氨酸常被蛋白酶去除，因此EGF氨基端40多個氨基酸即具有該因子的全部活性［21］.EGF分子的空間結構可分為相對獨立的N段和C段，這兩部分較為剛性，分別由兩對和一對相對柔性的二硫鍵相連，因此兩部分的空間位置相對可變，整個分子較為柔性.

1.3 表皮生長因子的生物學效應

EGF對表皮、間皮、內皮細胞在體內外都起作用，還影響組織器官的生長和分化.人們首次發(fā)現的EGF作用是能使乳鼠眼瞼早開6～7 d，牙齒早萌5～6 d，并伴有牙齒體積減小現象.此外，EGF還可促進心包膜、腎被膜、膽管和肺的發(fā)育.

(1)促進上皮細胞分裂增殖

EGF具有促進細胞的增殖和上皮再生的功能，可以促進細胞有絲分裂以及糖、蛋白質、DNA、RNA合成，在臨床上與很多疾病，如免疫性皮膚病、創(chuàng)面組織修復及牙周炎等的治療密切相關［22］，而在毛發(fā)囊泡細胞、鱗癌細胞中EGF卻有抗增殖效應;EGF可以明顯的增加創(chuàng)面的內膠原和細胞DNA含量，具有促進創(chuàng)面愈合作用，如促進外傷、手術、燒燙傷及各種激光損傷等引起的皮膚創(chuàng)傷愈合中有明顯的效果［23］;促進角膜上皮細胞的增殖，用來治療角膜損傷.EGF強烈的表達于角膜上皮的深層細胞和角膜緣上皮細胞、部分結膜上皮細胞和結膜下結締組織內成纖維細胞等眼表層組織.以自分泌或(和)旁分泌的方式與EGFR相結合，促進角膜損傷修復［24］;EGF是組織修復和細胞保護作用的內源性物質，在人類胃腸道、十二指腸粘膜潰瘍愈合過程中起著十分重要作用［25］，在治療腫瘤方面，最近國外用大量hEGF與毒素結合治療神經膠質瘤、乳腺瘤、皮膚瘤，已取得一定療效［26］.同時臨床上還可以應用EGFR單克隆抗體拮抗EGF對人牙齦上皮細胞的促增殖作用，為防止牙周炎提出了新的思路及其理論依據.

EGF促進組織修復的功能越來越受人們的重視，已被用于角膜、胃、腸道、肝臟、骨骼、神經等多種組織創(chuàng)傷的研究［27］.其研究和技術的進展即將在臨床上廣泛應用.

(2)EGF與某些癌性病變密不可分

研究表明EGF與腫瘤有三方面的關系:①某些腫瘤細胞可以自分泌EGF［28］直接作用于胞膜上EGF受體，加速其無抑制地異常增殖.②EGF受體的氨基酸排列和組成，與某些癌基因的產物具有高度的同源性，如EGF受體與病毒致癌基因src家族的產物有同源性，因此EGF受體不依賴EGF也能被激活，這種受體的持續(xù)激活可導致細胞不斷生長，這可能是導致細胞惡變的原因之一.③多種腫瘤細胞的EGF受體有過度表達現象，如鱗癌、多形性腦膠質細胞瘤、喉乳頭狀瘤等.

(3)EGF調節(jié)內分泌腺

EGF與多種內分泌腺之間有密切的相互調節(jié)的關系，可直接或間接影響多種內分泌腺的分泌.EGF 可以促進 GnRH、CRF、GH、ACTH、LH、hCG、hCS、PRL、皮質醇等的分泌，抑制翠酮、雌二醇、甲狀腺素等的分泌.另外，EGF可刺激人骨肉瘤細胞分泌甲狀旁腺激素樣肽(PTH-like peptide)，并刺激成骨細胞合成前列腺素 E2(PGE2)，促進胃泌素、膽囊收縮素、促胰酶素等胃腸道激素的分泌，并參與消化機能的調節(jié).

(4)對呼吸系統(tǒng)的作用

EGF可經自分泌或旁分泌方式對氣道上皮細胞的功能進行調控.作為一種肺內調節(jié)肽，具有抗氧化保護作用.它可以上調γ-谷氨酰轉肽酶的表達、加速外源性谷胱甘肽(GSH)向細胞內轉運和促進GSH合成、提高細胞的抗氧化能力及清除活性氧等.EGF還可通過細胞內信號轉導來調控原癌基因bcl-2的轉導水平.此外，EGF對肺泡Ⅱ型細胞增生有明顯的調控作用，如加速肺泡Ⅱ型細胞結構和功能分化，從而合成表面活性物質，促進胎肺成熟，進而參與肺損傷修復過程［29］.

(5)EGF在糖尿病及糖尿病腎病(DN)的發(fā)生發(fā)展中起重要作用

其檢測對DN的早期診斷、病情分析及臨床治療有一定的理論價值.對EGF與糖尿病性腺軸的損傷關系的研究表明，胰島素的作用部分由EGF調節(jié);胰島素或睪酮不足可導致EGF缺乏，而EGF缺乏可能是直接引起生精障礙的重要原因.

(6)EGF對生殖系統(tǒng)的主要作用

①影響睪丸發(fā)育和精子發(fā)生.②調節(jié)卵巢的發(fā)育與生殖功能.刺激卵母細胞發(fā)育、抑制人絨毛膜促性腺激素誘發(fā)的排卵效應、刺激顆粒細胞增殖、影響顆粒細胞的甾體激素分泌與肽類因子的分泌.③促進合子發(fā)育.④ 作為胚胎營養(yǎng)因子調節(jié)早期胚胎發(fā)育.既可通過EGFR提高早期胚胎卵裂率和囊胚發(fā)育率;又可活化Na/KaATP酶，加快囊胚腔內液體的積聚，促進囊胚腔的形成與擴展;還可間接地使肌動蛋白發(fā)生磷酸化，引起細胞粘著性以及胚胎卵裂球的分化發(fā)生改變.⑤通過激活胚泡和調節(jié)子宮接受性等途徑啟動胚泡植入.

(7)EGF作為具有神經營養(yǎng)活性的因子，在神經損傷后可以保護相應的背根神經節(jié)感覺神經元.此外，EGF還是一種腦腸肽神經遞質.

2 EGF作用機制

EGF通過與其細胞膜受體結合，在細胞內傳遞中構成一個復雜的代謝網絡，誘導受體自身磷酸化，激活受體酪氨酸蛋白激酶活性，催化多種底物蛋白酪氨酸殘基(Tvr)磷酸化，啟動、催化、維持與細胞生長、增殖有關的一系列生化過程.

2.1 基本作用機制

Ullrich等人［30-31］提出二聚體學說，即 EGF與EGFR結合后相鄰受體相互靠近形成二聚體，聚集的受體相互進行催化，使自身酪氨酸磷酸化，從而使受體的激酶區(qū)激活的觀點，該學說已得到了證實.

EGF首先與EGFR的胞外結合部位結合，導致受體分子發(fā)生二聚化，促使EGFR羧基末端的三個酪氨酸殘基(Tyr)自身磷酸化位點發(fā)生磷酸化，使受體酪氨酸激酶活化，從而磷酸化受體本身及下游的信號分子;磷酸化的受體通過其磷酸化酪氨酸殘基可與蛋白質的SH2結構域相互作用，結合胞內的信號轉導分子.已知EGFR的活化可以使細胞內三磷酸肌醇和二?；视驮龆?，結果引起細胞內游離鈣離子增多，激活磷酸蛋白激酶c和磷酸蛋白激酶A，從而介導各種信號轉導途徑，使細胞增殖和功能發(fā)生改變.誘導EGFR自身磷酸化的位點是在其羧基端1068、148、1173和氨基端一個位點的四個Tyr殘基［32］.

關于信息傳遞的過程，目前認為這種信息傳遞是以逐級放大形式來進行的.即被激活的一級信息分子去激活下一級信息分子，以此類推，每一次傳遞都是激活過程.而磷酸化的受體激酶區(qū)一方面能特異地與配體結合被磷酸化，另一方面又啟動另外的信息分子，依次將信息傳遞到效應分子，使細胞內第二信使三磷酸肌醇和二乙酰甘油增多，引起細胞內游離Ca2+增多，激活蛋白激酶C和腺苷酸環(huán)化酶，改變細胞的骨架結構，使細胞分化、分裂和增殖等.但時至今日，有關EGF的作用機理仍有許多問題有待進一步闡明.

2.2 三種蛋白酶的激活

(1)酪氨酸蛋白激酶(TPK)的激活:EGF受體的第三結構區(qū)具有特異性的TPK活性.對此酶底物的研究是了解EGF如何刺激細胞增殖的信號傳導過程的關鍵所在，EGF與受體結合誘導受體磷酸化，激活TPK.EGFR不僅能自身磷酸化，而且還使依賴于Ca2+離子的蛋白質或磷脂酰肌醇的磷酸化.利用定位突變的方法已經證明:TPK磷酸化與否對酶活性有重要調節(jié)作用，高活性的TPK可促使細胞增殖或癌變.

(2)C激酶(PKC)的激活:EGF與受體結合從而誘導受體結構產生變化，通過G蛋白降低受體TPK活性，從而導致EGF與受體復合物的高親合性結合快速下降，使受體受到功能上的下降調節(jié)，說明PKC活性與EGF密切相關，EGF表現的促細胞增殖、促癌作用有可能都是通過激活PKC來表現的，也可說明通過下降調節(jié)的反饋作用抑制了EGF受體促進細胞增殖的力.可能正是由于PKC這種反饋抑制作用才使得正常細胞中EGF受體不會導致細胞異常增生.

(3)CAPK的激活:可能核內EGF受體或OAG(1-油酰-2-乙酰-消旋甘油)以外的其它第二信使來增強NC3H/10的染色體蛋白激酶(CAPK)的活性，EGF對CAPK的活性的影響有助于說明核內EGF的作用過程.

以上三種蛋白激酶的激活，從而保障了EGF受體復合物的一系列生理功能［33］.

EGF的發(fā)現和研究的歷史十分短暫，但其特殊的生物學效應決定了它的廣泛應用.隨著研究的深入和臨床上的廣泛應用，一些疑難病癥，如重度燒傷、大面積創(chuàng)傷、消化道潰瘍、角膜嚴重損傷等，均有望迅速治愈.甚至目前的一些不治之癥:如神經損傷、惡性腫瘤、AIDS病等，也可能通過EGF的使用而有所緩解和恢復.可以預言，EGF的應用必將為今后生命科學研究帶來重大的飛躍.

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