脫脂米糠中清蛋白和球蛋白的提取工藝及氨基酸組成分析

王艷玲，張 敏

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100037）

穩(wěn)定化米糠提取米糠油之后，副產(chǎn)品脫脂米糠中還含有20%左右的蛋白質(zhì)，可用來進(jìn)一步開發(fā)米糠蛋白產(chǎn)品。與傳統(tǒng)生產(chǎn)植物蛋白的大豆粕、花生粕相比，米糠中蛋白質(zhì)的含量偏低，但作為世界第一大作物的加工副產(chǎn)品，僅在我國，米糠的年產(chǎn)量就達(dá)到了1000萬t，因此米糠中蛋白質(zhì)的數(shù)量是不容忽視的[1]。米糠蛋白含有的必需氨基酸完全，氨基酸組成更接近FAO/WHO的推薦模式；賴氨酸含量比大米胚乳、小麥面粉以及其他谷物中的都要高，生物效價（PER為2.0～2.5）與牛奶中的酪蛋白相近（PER為2.5），消化率達(dá)90%以上，是一種營養(yǎng)價值很高的植物蛋白。米糠蛋白還有一個最大的優(yōu)點(diǎn)：低過敏性，它是已知谷物中過敏性最低的，可用于嬰幼兒食品中[2]。米糠蛋白質(zhì)組成，根據(jù)Osborne提出的以溶解特性來劃分，可分為清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白，這四種蛋白質(zhì)的比例大致為37∶36∶22∶5，由此可見，米糠中清蛋白和球蛋白含量較高，其中清蛋白和球蛋白是由單鏈組成的低分子量蛋白質(zhì)，它為代謝活性蛋白質(zhì)，含有很多生理活性蛋白質(zhì)，在稻谷發(fā)芽早期可迅速啟動進(jìn)行生理作用[3]。盡管人們早就認(rèn)識到米糠的營養(yǎng)和藥用價值，但到目前為止，人們尚未很有效利用米糠蛋白。由于米糠中蛋白質(zhì)是一個復(fù)合的體系，含有清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶谷蛋白，是一個組成復(fù)雜的混合物；米糠蛋白的溶解性較差，極易發(fā)生沉淀，這主要是由于蛋白分子間存在很強(qiáng)的二硫鍵相互作用；米糠中的植酸和纖維素含量較高，這兩種物質(zhì)與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，使得蛋白質(zhì)不易分散出來[4]。國內(nèi)外已對小麥蛋白組分、大豆蛋白和玉米醇溶蛋白等進(jìn)行了大量的研究和應(yīng)用，張春紅和周小婷[5]采用Osborne法對麥胚蛋白進(jìn)行分級，得到麥胚清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4種組分；管驍和姚惠源[6]也按照Osborne蛋白分級提取方法對燕麥麩蛋白進(jìn)行了精細(xì)的分類，分別得到了燕麥麩清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。而目前對米糠蛋白組分研究的較少，本實(shí)驗(yàn)參照Osborne方法對米糠中蛋白組分進(jìn)行分級提取，依次利用蒸餾水和NaCl溶液來提取米糠中清蛋白和球蛋白，確定兩種米糠蛋白產(chǎn)品的最佳提取工藝并對兩種產(chǎn)品的氨基酸組成進(jìn)行測定，以期對今后米糠產(chǎn)品的深度開發(fā)和利用提供科學(xué)的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂米糠 黑龍江省北大荒米業(yè)有限公司提供（原料組成為：水分7.1%、蛋白質(zhì)19.1%、脂肪2.8%、纖維素23.1%、淀粉16.0%）；米糠蛋白 以脫脂米糠為原料采用堿溶酸沉法實(shí)驗(yàn)室自制的蛋白產(chǎn)品；牛血清白蛋白 美國Sigma公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

722型可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；pH-3c型pH計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠；SC-3614型低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；日立L8800型氨基酸自動分析儀 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米糠清蛋白和球蛋白的提取工藝[7]圖1為米糠清蛋白和球蛋白的提取工藝流程。取20g脫脂米糠，加一定料液比的蒸餾水浸提，在一定溫度下攪拌一段時間后，4000r/min離心20min得上清液和殘?jiān)?，其中上清液?jīng)酸堿調(diào)至清蛋白等電點(diǎn)4.1，4000r/min離心20min，將沉淀透析后冷凍干燥得米糠清蛋白粉；殘?jiān)^續(xù)用一定濃度的NaCl按一定的料液比在一定溫度下提取一段時間，再經(jīng)4000r/min離心20min得上清液，將上清液調(diào)至球蛋白等電點(diǎn)4.3，4000r/min離心20min，將沉淀透析后冷凍干燥得米糠球蛋白粉。

1.2.2 蛋白得率的測定方法[8]提取液中蛋白質(zhì)含量測定用福林酚法[9]測得。

蛋白得率（%）=提取液中蛋白質(zhì)量/米糠質(zhì)量×100

1.2.3 脫脂米糠清蛋白的提取工藝研究[10-11]本實(shí)驗(yàn)分別以料液比、提取時間、提取溫度為影響因子，對米糠清蛋白提取工藝進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

分別按照1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14的料液比加入蒸餾水，于50℃恒溫水浴鍋中提取2.5h，離心取上清液測定體積和蛋白含量，計(jì)算獲得蛋白得率。

以料液比1∶10加入蒸餾水，在50℃恒溫水浴鍋中分別提取1.5、2、2.5、3、3.5、4h，離心取上清液測得蛋白得率。

以料液比1∶10加入蒸餾水，分別在25、30、35、40、45、50、55℃下提取2.5h，離心取上清液測得蛋白得率。

通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取工藝參數(shù)范圍，以米糠蛋白得率為指標(biāo)，按L9（34）表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，選取的因素水平見表1。

1.2.4 米糠球蛋白的提取工藝研究 以蛋白得率為研究指標(biāo)，以料液比、提取時間、提取溫度、NaCl濃度為影響因素，對米糠清蛋白提取工藝進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

稱取5份殘?jiān)?，?%的NaCl溶液溶解，料液比分別在1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14的條件下，于45℃提取2h。離心后測定上清液的體積和蛋白含量，計(jì)算獲得的蛋白得率。

用2%的NaCl料液比為1∶10溶液溶解，分別在45℃提取1.5、2、2.5、3、3.5、4h時，離心測定上清液的蛋白得率。

用2%的NaCl料液比為1∶10溶液溶解，分別在溫度為35、40、45、50、55℃時，提取2h后，離心測定上清液的蛋白得率。

NaCl溶液的濃度分別在1%、2%、3%、4%、5%、6%時，料液比為1∶10，45℃提取2h。離心測定上清液的蛋白得率。

通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取工藝參數(shù)范圍，以米糠蛋白得率為指標(biāo)，按L9（34）表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，選取的因素水平如表2所示。

1.2.5 氨基酸組成分析[12]準(zhǔn)確稱取樣品20mg加入8mL的6mol/L HCl沖入氮?dú)夥饪?，?10℃烘箱內(nèi)水解22h，冷卻搖勻過濾，雙蒸水定容至50mL，潤洗3次以上，取1mL凍干至干燥，凍干后加入1mL 0.02mol/L HCl搖勻，14000r/min離心15min，吸取上清液0.8mL過0.45μm濾膜，上日立L8800型氨基酸自動分析儀。

2 結(jié)果與分析

2.1 清蛋白提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對米糠清蛋白得率的影響 提取米糠清蛋白的料液比與清蛋白得率的關(guān)系曲線如圖2所示。

由圖2測定結(jié)果可以看出，當(dāng)料液比在1∶12之前，米糠清蛋白得率隨料液比的增加而增大，料液比繼續(xù)增加，提取率的提高不明顯。由于米糠中含有一定量的膳食纖維和淀粉，具有較強(qiáng)的吸水膨脹能力，料液比過低時物料變得黏稠，流動性差，不易攪拌，蛋白不易溶出；清蛋白是水溶性蛋白，提高料液比可以提高蛋白質(zhì)的提取率[13]。但過高的料液比會降低提取液的蛋白濃度，增加生產(chǎn)成本。

2.1.2 提取時間對米糠清蛋白得率的影響 提取米糠清蛋白的時間與清蛋白得率的關(guān)系曲線如圖3所示。

由圖3可以看出，米糠清蛋白的得率在2h前隨著提取時間的增加蛋白得率明顯增加，3h后提取率增加變緩甚至出現(xiàn)輕微降低的趨勢。分析原因可能在于，隨著提取時間的延長，清蛋白大部分溶解于水中，提取率增加；3h后繼續(xù)延長提取時間，蛋白得率出現(xiàn)下降，這與陳季旺[14]的提取率隨時間延長而增大的結(jié)論不同，應(yīng)該與提取溫度有關(guān)。文獻(xiàn)采用在室溫條件下提取，蛋白溶出較慢，需要長時間。溫度的升高可加速蛋白溶出，在本文50℃的提取條件下，隨時間延長可能使蛋白發(fā)生了少部分水解或聚合反應(yīng)，從而使提取液中蛋白質(zhì)的含量略微降低[15]。

2.1.3 提取溫度對米糠清蛋白得率的影響 提取米糠清蛋白的溫度與清蛋白得率的關(guān)系曲線如圖4所示。

由圖4可以看出，隨著溫度的升高，米糠清蛋白得率不斷增加，45℃時蛋白得率達(dá)到最大，當(dāng)溫度超過45℃時蛋白得率開始下降?？赡艿脑蚴堑鞍装l(fā)生水解引起。有報(bào)道[16]稱，米糠開始糊化溫度為60～75℃，淀粉的糊化使原來的懸浮液變成了粘性很強(qiáng)的淀粉糊，阻礙了蛋白質(zhì)的溶出，從而降低了蛋白質(zhì)的得率。本研究獲得的提取清蛋白和球蛋白的提取溫度與其他文獻(xiàn)[14]報(bào)道不同，可能與原料來源、顆粒狀態(tài)以及提取蛋白種類等不同有關(guān)。

2.2 清蛋白提取的正交實(shí)驗(yàn)

以蛋白得率作為評價指標(biāo)，清蛋白的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3和表4所示。

對表3的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析可知，影響脫脂米糠中清蛋白得率因素的主次順序?yàn)锳＞B＞C，即料液比對清蛋白得率的影響最大，提取時間次之，提取溫度的影響最小。最佳工藝參數(shù)組合為A3B3C2，即正交實(shí)驗(yàn)表中的第9組實(shí)驗(yàn)，在料液比為1∶14，提取時間為3h，溫度為45℃條件下，可獲得最高提取率（14.64%）的米糠清蛋白產(chǎn)品。

表4的方差分析結(jié)果表明，料液比對米糠清蛋白提取得率影響顯著（F比＞F臨界值），而其他因素對米糠清蛋白提取得率影響不顯著，即料液比為清蛋白提取的關(guān)鍵因素。

2.3 提取球蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 料液比對米糠球蛋白得率的影響 提取米糠球蛋白的料液比對球蛋白得率的關(guān)系曲線如圖5所示。由圖5可以看出，提取米糠球蛋白的料液比在小于1∶10時，隨料液比增大米糠球蛋白得率增大；料液比大于1∶10后，繼續(xù)增加料液比，米糠球蛋白的蛋白得率出現(xiàn)降低。這與蛋白質(zhì)的分解及提取液使球蛋白濃度降低有關(guān)。與清蛋白相比，球蛋白的最佳料液比相對減少了很多，分析原因可能是由于經(jīng)過清蛋白提取后，原料已吸收一部分水分，再提取球蛋白時，所需料液比明顯降低。

2.3.2 提取時間對米糠球蛋白得率的影響 提取米糠球蛋白的反應(yīng)時間與球蛋白得率的關(guān)系曲線如圖6所示。

由圖6可知，球蛋白得率在2h之前隨時間延長而增加，在2h處達(dá)到最大值；在2h之后隨時間延長蛋白得率出現(xiàn)降低趨勢，分析原因可能是隨提取時間延長蛋白發(fā)生了部分水解和聚合反應(yīng)，使蛋白質(zhì)的提取率降低。

2.3.3 提取溫度對米糠球蛋白得率的影響 提取米糠球蛋白的反應(yīng)溫度與球蛋白得率的關(guān)系曲線如圖7所示。

由圖7可知，提取溫度在50℃之前，球蛋白得率隨提取溫度的升高逐漸增大，在50℃時球蛋白得率達(dá)到最大值，在50℃之后隨溫度的繼續(xù)升高，球蛋白得率緩慢下降。與清蛋白相比，球蛋白的提取溫度較高，這與球蛋白的水溶性差有關(guān)。

2.3.4 NaCl濃度對米糠球蛋白得率的影響 提取米糠球蛋白的反應(yīng)NaCl濃度與球蛋白得率的關(guān)系曲線如圖8所示。

由圖8可以看出，在NaCl濃度為3%時蛋白得率達(dá)到最大值，之后呈下降趨勢。可見高濃度的鹽并不能增大得率，這與朱科學(xué)[17]提取小麥胚芽球蛋白時，使用的NaCl濃度相一致。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鹽濃度越高，混合液粘度越大，實(shí)驗(yàn)操作越不易進(jìn)行。

2.4 球蛋白正交實(shí)驗(yàn)

以球蛋白得率作為評價指標(biāo)，球蛋白的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5和表6所示。

對表5的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析可知，影響脫脂米糠中球蛋白得率因素的主次順序?yàn)镈＞A＞C＞B，即NaCl濃度對球蛋白得率的影響最大，料液比次之，提取時間的影響最小。最佳工藝參數(shù)組合為A1B1C2D2，即料液比為1∶10、提取時間為2h、溫度為50℃，NaCl濃度為3%。

表6方差分析結(jié)果表明，NaCl濃度、料液比對米糠球蛋白提取得率影響顯著（F比＞F臨界值），而其他因素對米糠清蛋白提取得率影響不顯著，即NaCl濃度、料液比為球蛋白提取的關(guān)鍵因素。

在較優(yōu)參數(shù)組合條件下進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，脫脂米糠提取球蛋白的蛋白得率為4.25%、4.31%、4、29%，平均蛋白得率為4.28%，高于正交表中所有組合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明了正交實(shí)驗(yàn)的可靠性。

2.5 氨基酸組成分析

表7是測定的米糠蛋白、米糠清蛋白和米糠球蛋白的氨基酸組成數(shù)據(jù)結(jié)果。

米糠蛋白是一個包含清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白的蛋白混合物體系，清蛋白和球蛋白則是具有不同天然構(gòu)象的混合物。從表7可以看出，米糠蛋白和清蛋白、球蛋白氨基酸含量有所不同。米糠蛋白的各種氨基酸含量大多都低于清蛋白和球蛋白，只有丙氨酸含量明顯高于二者，甘氨酸含量大于米糠清蛋白而小于米糠球蛋白，賴氨酸和蘇氨酸含量低于米糠清蛋白高于米糠球蛋白；這三種米糠的蛋白產(chǎn)品中，丙氨酸和甘氨酸的含量均高于其他氨基酸。在米糠蛋白的氨基酸組成中含有半胱氨酸，而在其他二種蛋白中沒有檢測出半胱氨酸。半胱氨酸是一種具有生理功能的氨基酸，是組成蛋白質(zhì)的20多種氨基酸中惟一具有還原性基團(tuán)巰基（-SH）的氨基酸。從親水性氨基酸和疏水性氨基酸的含量來看，這三種蛋白產(chǎn)品的親水性氨基酸含量相差較大，疏水性氨基酸的含量相差不多，且親水性氨基酸的含量遠(yuǎn)高于疏水性氨基酸的含量。有研究表明[18]，可以根據(jù)蛋白產(chǎn)品的氨基酸含量來判斷其功能性質(zhì)。有關(guān)米糠蛋白產(chǎn)品功能性質(zhì)有待進(jìn)一步深入的研究。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，米糠蛋白和清蛋白、球蛋白中均含有人體必需的七種氨基酸（因酸水解破壞了色氨酸導(dǎo)致測不出），其組成均接近FAO/WHO模式，并且苯丙氨酸+酪氨酸含量遠(yuǎn)高于FAO/WHO模式推薦值。組氨酸雖不是人體必需氨基酸，但對于嬰兒而言卻是必需氨基酸，米糠清蛋白中組氨酸的含量相對較高。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對米糠中清蛋白和球蛋白提取工藝進(jìn)行研究，結(jié)果表明，料液比對脫脂米糠中清蛋白得率影響顯著，而提取時間、提取溫度影響不顯著。清蛋白提取最佳工藝為：料液比1∶14、提取時間3h、溫度45℃，清蛋白得率為14.64%。NaCl濃度和料液比對米糠球蛋白的提取得率影響顯著，球蛋白提取的最佳工藝為料液比1∶10、提取時間2h、溫度50℃、NaCl濃度3%，球蛋白得率為4.28%。

米糠蛋白和清蛋白、球蛋白進(jìn)行的氨基酸分析表明，米糠蛋白產(chǎn)品中氨基酸組成平衡，富含功能性氨基酸，氨基酸的含量接近FAO/WHO推薦模式，是較好的植物蛋白質(zhì)來源。

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