家蠅幼蟲消化器官中纖維素酶的組成及酶活性分析

張 姝，胡 蓉，吳建偉，國 果，付 萍

(貴陽醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室，貴陽 550004)

纖維素酶是水解纖維素及其衍生物生成葡萄糖的三種酶的組合酶系，包括內(nèi)切β－1，4－葡聚糖酶 (endo－β－1，4 glucanase，EC 3.2.1.4，EG)，外切β－1，4－葡聚糖酶 (exo－β－1，4－glucanase，EC3.2.1.91，CBH)和β－葡萄糖苷酶(β－glucosidase，EC 3.2.1.21，BG)，這三種酶各有專一性又能相互協(xié)調(diào)，通常只有在這三種酶的協(xié)同作用下，才能把纖維素分子降解為葡萄糖(Duan and Feng，2010;Clarke，1997)。目前已有研究表明天牛 (殷幼平等，2000;Wei YD，et al.，2006;索風(fēng)梅等，2007)和白蟻 (曾文慧等，2011;Nathan， etal.， 2011;Tokuda， etal.，2012)等昆蟲的消化器官內(nèi)均有完整的纖維素酶系，并以此獲得生存所需的能量。家蠅 Musca domestica是一種分布廣泛、數(shù)量眾多的雙翅目昆蟲，人工養(yǎng)殖的家蠅幼蟲通常在富含纖維素的麥麩中進(jìn)行喂養(yǎng)，家蠅的消化器官內(nèi)是否也含有纖維素酶引起我們的關(guān)注。本研究通過DNSA法(Miller，1959)，以濾紙為底物檢測家蠅各消化器官是否具有纖維素酶活性，并通過纖維素酶復(fù)合酶系3種酶的特異性底物檢測家蠅纖維素酶的組成，同時(shí)初步探討溫度、反應(yīng)時(shí)間對家蠅纖維素酶活性的影響，為今后纖維素酶的來源增加新的家族和類型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)昆蟲

家蠅由貴陽醫(yī)學(xué)院人體寄生蟲教研室保存。養(yǎng)蠅房恒溫25℃，光周期12L∶12D，成蟲以水、奶粉和白糖喂食，幼蟲以麥麩和水為食料。

1.1.2 主要試劑

水楊苷、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素(Sigma)，定性濾紙 (杭州特種紙業(yè)有限公司)，3，5－二硝基水楊酸 (DNSA，Genview)，SK3071非干擾型蛋白濃度檢測試劑盒 (上海生工生物工程有限公司)。

1.1.3 主要儀器

SZ61立體顯微鏡 (OLYMPUS)，CT15RE高速冷凍離心機(jī) (HITACHI)，超低溫電冰箱(Thermo scientific)，752N紫外分光光度計(jì) (上海精密科學(xué)儀器有限公司)，電子天平 (北京賽多利斯系統(tǒng)儀器有限公司)，超純水器 (艾柯公司)，移液器 (Eppendorf)。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備

新鮮3齡家蠅幼蟲洗凈體表上的飼料殘?jiān)笥贸兯?～3 h，使其吐凈體內(nèi)污物，用75%乙醇對家蠅3齡幼蟲表面消毒30 min，超純水清洗2次，濾紙吸干體表水分，20℃預(yù)凍10 min，解剖顯微鏡下分離家蠅3齡幼蟲的唾液腺、前腸、中腸、后腸。按0.15 g組織加入1 mL 0.1M醋酸－醋酸鈉緩沖液 (pH=5.6)，冰浴研磨，在12000 rpm，4℃，離心10 min，取上清液即為纖維素酶的粗酶液，置于－80℃冰箱中待用。

1.2.2 粗酶液蛋白定量

采用BCA蛋白濃度測定法進(jìn)行測定(Smith et al.，1985)。取10 μL家蠅粗酶液和6種不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液加入2 mL的BCA工作液，在480 nm波長處測定其吸收值，計(jì)算出粗酶液的蛋白濃度。

1.2.3 濾紙酶活性測定

采用DNSA法測定，每個(gè)離心管中放入10 mg定量濾紙片，再加入0.3 mL 0.1 M醋酸－醋酸鈉緩沖液 (pH5.6)將其浸潤。加入粗酶液0.1 mL混勻后在50℃水浴條件下反應(yīng)60 min，立即加入0.3 mL DNSA顯色劑終止反應(yīng)，在沸水浴顯色5 min，冷卻至室溫后，用0.1M醋酸－醋酸鈉緩沖液定容至5 mL。設(shè)陰性對照 (以緩沖液代替粗酶液)。于紫外分光光度計(jì)測OD540值，每一個(gè)樣品3個(gè)生物重復(fù)，每組做3個(gè)重復(fù)。從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄糖含量。在 pH=5.6、50℃反應(yīng)60 min的條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 umoL葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活性單位 (IU)。纖維素酶活性大小用比活力 (Willis et al.，2010)，即每mg蛋白中的酶單位數(shù)量來表示。纖維素酶比活力(IU/mg)=(m×5.56)/(V×C×t)。m:產(chǎn)生的葡萄糖含量 (mg);C:粗酶液蛋白濃度(mg/mL);V:反應(yīng)液中加入的粗酶液體積(mL);t:反應(yīng)時(shí)間 (min)。

1.2.4 β－葡萄糖苷酶、內(nèi)切β－1，4－葡聚糖酶、外切β－1，4－葡聚糖酶活力的測定

采用DNSA法測定，在離心管中分別加入1%水楊苷、1%羧甲基纖維素鈉、1%微晶纖維素0.3 mL后加入粗酶液0.1 mL，混勻后在50℃水浴條件下反應(yīng)60 min，立即加入0.3 mL DNSA顯色劑終止反應(yīng)，在沸水浴顯色5 min，冷卻至室溫后，用0.1M醋酸－醋酸鈉緩沖液定容至5 mL。設(shè)陰性對照 (以緩沖液代替粗酶液)。于紫外分光光度計(jì)測OD540值，每一個(gè)樣品3個(gè)生物重復(fù)，每組做3個(gè)重復(fù)。計(jì)算方法同1.2.3。

1.2.5 纖維素酶特性初步研究

1.2.5.1 最適反應(yīng)時(shí)間的測定取0.1 mL粗酶液分別與0.3 mL的1%羧甲基纖維素鈉、1%水楊苷和1%微晶纖維素充分混合，分別溫浴10 min，20 min，40 min，60 min，80 min，100 min，120 min后，按1.2.5所述方法分別測定EG、BG和CBH的酶活性，確定最適反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5.2 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的測定

取0.1 mL粗酶液分別與0.3 mL的1%羧甲基纖維素鈉、1%水楊素和1%微晶纖維素充分混合，分別在 20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃溫度下水浴，按1.2.5所述方法分別測定EG、BG、CBH的酶活性，以溫度為為橫坐標(biāo)，纖維素酶活力為縱坐標(biāo)建立反應(yīng)影響曲線。熱穩(wěn)定性測定的方法 (Teng et al.，2010;Liu et al.，2011)。將粗酶液在 20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃和80℃溫浴1 h后，分別與不同底物在50℃、pH5.6條件下反應(yīng)1 h，檢測3種酶的活性。以最適溫度和最適反應(yīng)時(shí)間條件下粗酶液的酶活性(設(shè)為T0)為對照。

1.2.5.3 家蠅纖維素酶的混合底物實(shí)驗(yàn)將粗酶液與纖維素酶3種底物 (1%羧甲基纖維素鈉、1%水楊素和1%微晶纖維素)混勻后，按1.2.5所述方法測定在相同條件下EG、BG和CBH的綜合作用。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同組織樣本中各種纖維素酶活性皆用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，并用單因素方差分析檢驗(yàn)，組間比較用q檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠅粗酶液蛋白濃度測定

根據(jù)蛋白定量試劑盒說明書，讀取不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA吸光度值，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各待測粗酶液蛋白濃度 (圖1，表1)。

圖1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Protein standard curve

表1 家蠅3齡幼蟲不同組織粗酶液蛋白含量 (mg/mL)Table 1 The protein content in different organizations from Musca domestica larvae(mg/mL)

2.2 濾紙酶活性測定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。吸光度 (x)與葡萄糖濃度 (y)之間呈良好的線性關(guān)系。通過FPA濾紙酶活性 (filter paper activity，F(xiàn)PA)檢測，家蠅3齡幼蟲唾液腺、前腸、中腸、后腸粗酶液均具有降解濾紙產(chǎn)生葡萄糖的能力，濾紙酶活性見圖3。如圖3所示，家蠅3齡幼蟲消化器官皆具有濾紙酶活性，在消化器官中，中腸的濾紙酶活性最高，其次是唾液腺，前腸和后腸較低。

2.3 β-葡萄糖苷酶、內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶、外切β-1，4-葡聚糖酶活性的測定

通過DNSA顯色法檢測到家蠅3齡幼蟲唾液腺、前腸、中腸、后腸粗酶液均具有纖維素復(fù)合酶系中的3種酶，即CBH、EG和BG。這3種酶在不同消化器官中的配比關(guān)系和活性表現(xiàn)存在一定的差異。在相同的條件下，3種纖維素酶中，CBH在家蠅3齡幼蟲各組織中酶活性都是最高的，EG除了在前腸和后腸的酶活性比列比BG的略高以外，其它組織中BG酶活性較EG的高。(圖4，表2)。

圖4 家蠅3齡幼蟲不同組織纖維素酶活性Fig.4 Distribution of three enzymes in digestive organs from Musca domestica larvae

表2 家蠅3齡幼蟲各組織3種纖維素酶活性所占比例 (%)Table 2 Proportion of activity of three enzymes in digestive organs from Musca domestica larvae

2.4 家蠅消化道內(nèi)纖維素酶特性初步研究

2.4.1 最適反應(yīng)時(shí)間的測定

在不同反應(yīng)時(shí)間下測定EG、CBH和BG的酶活性，結(jié)果如圖5所示.粗酶液與底物反應(yīng)10 min至60 min后，3種纖維素酶隨反應(yīng)時(shí)間的增加，其酶活性也逐漸增強(qiáng)，在60 min時(shí)活性到達(dá)最高。而后隨著反應(yīng)時(shí)間的延長酶活性逐漸降低。據(jù)此確定家蠅纖維素酶活最適反應(yīng)時(shí)間為60 min。

圖5 不同反應(yīng)時(shí)間下3種纖維素酶的活性Fig.5 Activities of the cellulases at different time

2.4.2 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的測定

圖6 不同反應(yīng)溫度下3種纖維素酶的活性Fig.6 Activities of the cellulases at different temperature

如圖6所示，家蠅EG酶活性從20℃開始上升，到50℃時(shí)酶活性最高;BG在40至60℃時(shí)酶活較高，50℃時(shí)酶活性最高;CBH的酶活性在40℃至70℃酶的活性較高，在50℃時(shí)達(dá)到最高.因此確定3種酶最適反應(yīng)溫度為50℃。家蠅纖維素酶對溫度的穩(wěn)定性研究中發(fā)現(xiàn)，家蠅消化道內(nèi)的BG、EG和CBH具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在較低溫度時(shí) (20℃，30℃，40℃)僅降低 6.10% ～21.11%的活性，60℃是家蠅消化道內(nèi)纖維素酶活性熱穩(wěn)定性變化的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，再此溫度處理下酶活性下降了50.1% ～64.98%，在80℃以上基本完全失活 (表3)。

表3 家蠅3種纖維素酶的熱穩(wěn)定性Table 3 Stability of three enzymes from Musca domestica at different temperature

2.4.3 家蠅纖維素酶的混合底物實(shí)驗(yàn)

粗酶液與3種特異性底物混合進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，測定家蠅纖維素酶體內(nèi)EG、CBH和BG三種酶的綜合做作用，其酶活性為 (1.045±0.030)IU/mg。

3 結(jié)論與討論

昆蟲與環(huán)境中的纖維素接觸非常密切，越來越多的研究證實(shí)等翅目、鞘翅目、鱗翅目、雙翅目昆蟲具有纖維素酶活性，它們是自然界中協(xié)助進(jìn)行碳循環(huán)的一類重要的昆蟲。如斑蝥 (Sami et al.，2011)、白蟻 (Nathan et al.，2011;曾文慧等，2011;Tokuda et al.，2012)、草地貪衣蛾(Marana et al.，2004)和大蚊科 (Willis et al.，2010)等已有纖維素酶活性的報(bào)道。本研究以濾紙為底物證實(shí)家蠅具有纖維素酶活性，這為家蠅能夠從富含纖維素的物質(zhì)中獲得生存所需的能量提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。家蠅正是由于體內(nèi)存在高效的纖維素酶才具有將纖維素轉(zhuǎn)化為自身新陳代謝所需小分子碳水化合物的能力。目前已有白蟻纖維素酶在消化道定位的報(bào)道 (曾文慧等，2011)，天牛的纖維素酶存在部位也有了一些研究 (Wei et al.，2006;索風(fēng)梅等，2007)。但沒有學(xué)者對家蠅纖維素酶種類和分布進(jìn)行研究。本研究通過纖維素酶復(fù)合酶系3種酶的特異性底物檢測到家蠅3齡幼蟲唾液腺、前腸、中腸和后腸粗酶液均具有β－葡萄糖苷酶、內(nèi)切β－1，4－葡聚糖酶和外切β－1，4－葡聚糖酶，為進(jìn)一步研究家蠅消化纖維素的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

纖維素酶作為一種復(fù)雜酶系，酶系中各種酶發(fā)揮各自作用將纖維素降解為單糖。根據(jù)作用方式，首先EG水解纖維素非結(jié)晶區(qū)生成大量還原性或非還原性末端;然后CBH再進(jìn)行降解生成大量纖維二糖，最后再由BG將纖維二糖水解成葡萄糖，從而完成降解纖維素的反應(yīng) (Beguin and Aubert，1994)。在纖維素降解的過程中可能存在酶的活性中心與不同底物間的競爭性抑制作用(王驥，2003;段旭等，2009)。這種競爭必將導(dǎo)致生成的單糖 (葡萄糖)的量減少。從混合底物實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得到證實(shí)，家蠅纖維素酶系各酶系組分間也顯示出生成單糖減少。

在進(jìn)一步分析家蠅纖維素酶的性質(zhì)中可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，能夠更好的促進(jìn)家蠅纖維素酶酶促反應(yīng)。在不同溫度下用粗酶液與底物作用，家蠅纖維素酶對溫度比較敏感。在較低溫度下，酶與底物親和性弱，酶的活性顯著降低，這可能與它的生活習(xí)性有關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)家蠅纖維素酶與環(huán)毛蚓 (張炎，2006)和黑胸散白蟻 (許利霞等，2012)比較，顯示出較好的穩(wěn)定性且具有較高活性。這表明家蠅纖維素酶具有很好的應(yīng)用前景。

在家蠅的消化系統(tǒng)內(nèi)，纖維素酶的主要組成及其分布各不相同。這可能是與家蠅消化器官的功能不同造成的。家蠅的唾液腺主要是分泌唾液對吞咽食物起到潤滑和幫助消化作用，因此纖維素酶較為豐富，而前腸是儲存食物和調(diào)節(jié)食物進(jìn)入中腸的作用，所以該處的酶活性較低。家蠅中腸是消化吸收的最主要的部位，其體積約占了消化道總長度的3/4，使食物有充分的時(shí)間與纖維素酶作用，因此該處的酶活性最高，后腸是排出食物殘?jiān)⒋x廢物和吸回水分等的部位，不是降解纖維素酶的主要部位，所以酶活性也相對最低。本研究從對該物種纖維素酶分布情況進(jìn)行分析，為家蠅纖維素酶主要是家蠅自身分泌提供了理論依據(jù)。

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