首次發(fā)現(xiàn)扶桑綿粉蚧體內(nèi)存在沃爾巴克氏體

唐 遠(yuǎn)，王 超，陸永躍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系，廣州 510642)

Wolbachia是一種立克次氏體細(xì)菌，有立克次體的一般特征，其家族中的成員屬于Proteobacteria的α亞門，為革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛分布于節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)，已報(bào)道侵染了大約20%的昆蟲種類(Werren， 1997;Harrietand Henk， 2003)。Wolbachia隨母系遺傳，能在昆蟲的個(gè)體、群體間迅速進(jìn)行橫向傳播，參與調(diào)控寄主的多種生殖活動(dòng)，包括誘導(dǎo)生殖不親和、孤雌生殖、雌性化、殺雄性及增強(qiáng)雄性或雌性的生殖力等，近年來Wolbachia的功能、作用規(guī)律和機(jī)制等成為了國際生物學(xué)研究的熱點(diǎn) (龔鵬等，2002;施婉君等，2002)。

目前確認(rèn)昆蟲體內(nèi)是否感染W(wǎng)olbachia的方法是主要是檢測(cè)其細(xì)胞周期基因16S rDNA、23S rDNA、ftsZ和編碼Wolbachia表面蛋白的wsp基因(surface protein of Wolbachia) (龔鵬和沈佐銳，2002)。Zhou等 (1998)在wsp序列分析的基礎(chǔ)上，將沃爾巴克氏體細(xì)分為12個(gè)亞群(subgroup)，并設(shè)計(jì)了這12個(gè)亞群的wsp基因診斷的PCR擴(kuò)增特異引物，建立了相對(duì)完善的沃爾巴克氏體wsp基因診斷技術(shù)。此后，在GenBank中登錄并獲得專利號(hào)的 wsp基因越來越豐富，為Wolbachia的研究提供了大量的資料。目前該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于昆蟲 (龔鵬等，2002;孫曉等，2004)、蜘蛛 (楊啟偉等，2008)、螨類 (苗慧等，2004;Gotoh et al.，2005)等體內(nèi)Wolbachia的檢測(cè)。

扶桑綿粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley屬同翅目、粉蚧科，1898年在美國新墨西哥州首次發(fā)現(xiàn)并定名 (Tinsley，1898)。2005年該蟲在印度和巴基斯坦棉花上暴發(fā)成災(zāi)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，2006年兩國的旁遮普邦棉花均減產(chǎn)12%，2007年減產(chǎn)達(dá)到 40% (Dutt，2007;Hodgson et al.，2008)。2008年8月在我國廣州發(fā)現(xiàn)該蟲危害 (武三安和張潤志，2009;Lu et al.，2011)。由于它是棉花生產(chǎn)的潛在重要害蟲，2010年5月我國將扶桑綿粉蚧增列為全國農(nóng)業(yè)、林業(yè)植物檢疫性有害生物 (王琳和楊曉朱，2010)。該蟲寄主范圍廣，包括葫蘆科、豆科、茄科、唇形科、錦葵科、藜科等100多種植物，其中棉花、煙草、南瓜、番茄等是重要的經(jīng)濟(jì)作物 (Tinsley，1898;陸永躍等，2008;孫峰和陸永躍，2011)。風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果顯示，該蟲對(duì)我國各大棉區(qū)棉花生產(chǎn)均存在巨大威脅 (王艷平等，2009)。因此，掌握該蟲生物學(xué)、生態(tài)學(xué)，研制有效的防治策略和技術(shù)十分必要。開展扶桑綿粉蚧體內(nèi)共生菌Wolbachia研究，對(duì)了解該蟲入侵種群生殖生物學(xué)變化、開發(fā)應(yīng)用Wolbachia控制害蟲的新途徑等均具有重要意義。本文應(yīng)用wsp基因診斷技術(shù)檢測(cè)了入侵我國的扶桑綿粉蚧種群中沃爾巴克氏體存在情況，首次發(fā)現(xiàn)了Wolbachia感染現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 扶桑綿粉蚧樣品及其保存

供試的扶桑綿粉蚧于2011年11月采自海南省海口市，采回來的粉蚧在室內(nèi)用扶桑進(jìn)行連續(xù)飼養(yǎng)繁殖5代，獲得的雌成蟲以無水乙醇浸泡，保存于－40℃的低溫冰柜備用。

1.2 總DNA的提取

總DNA的提取在參照溫碩洋和何曉芳(2003)的方法并進(jìn)行一些修改:取單頭雌成蟲放入1.5 mL的離心管，先加入6 μL的STE(100 mM NaCl;10 mM Tris － Cl，pH 8.0;1 mM EDTA，pH 8.0)，研磨勻漿，加入54 μL的STE來清洗研磨杵，再加入6 μL蛋白酶K(200 μg/mL)，研磨液在56℃恒溫器中消化2 h，消化后的產(chǎn)物在95℃孕育45 s，14000 r/min離心1 min沉淀殘?jiān)?，上清液作為做PCR的模板或保存在 －20℃冰箱中備用。

1.3 wsp基因擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

wsp基因的PCR擴(kuò)增方法參照Zhou等 (1998)。擴(kuò)增引物為:wsp81F(5'TGGTCCAATAAGT GATGAAGAAAC)和wsp 691R(5'AAAAATTAAACGCTACTCCA)，由上海生工科技有限公司合成。

擴(kuò)增體積為25 μL:含模板DNA(扶桑綿粉蚧總DNA)1 μL，20 μmol/L正向引物和反向引物各 1 μL，2.5 mM dNTP 混合液 2 μL，5 U/μL Taq酶 (TaKaRa)0.2 μL，10×buffer(含鎂離子)2.5 μL，無菌雙蒸水 17.3 μL。

擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性 4 min;94℃ 45 s;54℃45 s;72℃ 1 min;擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè) (電壓72 V，電泳緩沖液為1×TAE)，紫外燈下觀察結(jié)果，以明確wsp基因的存在與否及擴(kuò)增片段的大小。

1.4 wsp基因片段克隆及測(cè)序

用電泳凝膠回收試劑盒 (天根生化科技 (北京)有限公司生產(chǎn))對(duì)目的片段進(jìn)行分離純化后，克隆到該公司的pGM－T載體中，篩選出陽性克隆，將轉(zhuǎn)化菌株送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并在NCBI中進(jìn)行序列比較。

2 結(jié)果與分析

特定基因區(qū)段的PCR特異性擴(kuò)增已經(jīng)成為鑒定昆蟲體內(nèi)細(xì)菌共生的常規(guī)途徑。利用沃爾巴克氏體wsp基因的1對(duì)通用引物 (81F，691R)，成功地從扶桑綿粉蚧雌成蟲的總DNA中擴(kuò)增到一段550 bp左右的wsp基因片段 (圖1)，并通過5次驗(yàn)證。經(jīng)過測(cè)序分析，所得wsp基因序列實(shí)際長(zhǎng)度為540 bp，具體序列見圖 2。將所得序列與GenBank中注冊(cè)的Wolbachia核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，同源性最高可達(dá)到99%，證明扶桑綿粉蚧雌成蟲體內(nèi)存在Wolbachia。

圖1 扶桑綿粉蚧沃爾巴克氏體wsp基因PCR特異性擴(kuò)增片段 (約550bp)Fig.1 Specific amplified fragment of Wolbachia wsp by PCR in the solenopsis mealybug

圖2 扶桑綿粉蚧雌成蟲體內(nèi)沃爾巴克氏體wsp基因序列Fig.2 Wsp sequence of Wolbachia infecting the solenopsis mealybug female

3 結(jié)論與討論

本文的研究為入侵我國的扶桑綿粉蚧感染W(wǎng)olbachia提供了分子生物學(xué)依據(jù)，明確了Wolbachia對(duì)扶桑綿粉蚧的感染現(xiàn)象。通過對(duì)CABI、JCR、CNKI等文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫以及GenBank的檢索，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外對(duì)Wolbachia在粉蚧體內(nèi)的共生現(xiàn)象鮮有報(bào)道，僅Paul(2006)在著作中提及來自巴西的粉蚧 Phenacoccus herreni體內(nèi)檢測(cè)到Wolbachia的存在。因此本文關(guān)于在扶桑綿粉蚧體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Wolbachia共生的現(xiàn)象在國內(nèi)外尚屬首次。

扶桑綿粉蚧是我國近年來的一種新外來入侵害蟲，具有繁殖能力強(qiáng)，擴(kuò)散迅速，危害嚴(yán)重的特點(diǎn)。兼營孤雌生殖、繁殖能力強(qiáng)成為其種群易擴(kuò)散傳播并成災(zāi)的有利因素之一 (Vennila et al.，2010)。由于不需與雄性個(gè)體交配，孤雌生殖個(gè)體更容易以少量種群進(jìn)入新生境并建立種群。在新的寄主上不需要雄蟲的存在也能大量產(chǎn)卵，孵化出新的后代，進(jìn)行新一輪的生殖和傳播。其特殊的繁殖方式和強(qiáng)繁殖能力加強(qiáng)了該蟲傳播和擴(kuò)散的可能性和風(fēng)險(xiǎn)性。扶桑綿粉蚧的孤雌生殖可能與沃爾巴克氏體的共生有關(guān)，已證實(shí)沃爾巴克氏體參與至少40多個(gè)物種的孤雌生殖 (Stouthamer，1997)。未來的研究將進(jìn)一步針對(duì)扶桑綿粉蚧的不同地理種群檢測(cè)其是否感染沃爾巴克氏體，明確我國扶桑綿粉蚧感染W(wǎng)olbachia的基本類群及在種群中的感染率，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行抗生素處理試驗(yàn)，以探究扶桑綿粉蚧的生殖方式與Wolbachia相關(guān)性，分析Wolbachia對(duì)我國扶桑綿粉蚧生殖活動(dòng)的具體作用。

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