鹽酸米托蒽醌誘導(dǎo)人鼻咽癌細胞CNE—2凋亡的研究

王煒　劉斌　童春義　程小廣　陳稚　趙毅　胡新榮

[摘要] 目的 探討鹽酸米托蒽醌誘導(dǎo)人鼻咽癌細胞CNE-2凋亡作用和機制。 方法 用CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒檢測鹽酸米托蒽醌對CNE-2細胞生長的抑制作用，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)藥物積聚量與細胞凋亡率之間的關(guān)系，共聚焦檢測鹽酸米托蒽醌在細胞中的定位。 結(jié)果 鹽酸米托蒽醌對CNE-2細胞生長具有抑制作用，呈時間和劑量依賴性，并能有效誘導(dǎo)細胞凋亡，其在細胞中主要以斑點形式分布在細胞質(zhì)中。 結(jié)論 鹽酸米托蒽醌能抑制人鼻咽癌細胞CNE-2細胞生長，并誘導(dǎo)細胞凋亡，CNE-2細胞的藥物敏感性與藥物在細胞內(nèi)的分布位置有直接關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 鹽酸米托蒽醌；鼻咽癌；生長抑制；凋亡

[中圖分類號] R739 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2013）01（b）-0015-02

鼻咽癌是亞洲常見的頭頸部惡性腫瘤之一，目前臨床上治療手段以放療為主，5年總生存率為59%～75%[1-2]。多項研究均證實，對復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的鼻咽癌，同步放、化療可使總生存率提高8%～30%[3-4]，但此方法的最佳組合模式和新化療藥物的療效尚有待明確。鹽酸米托蒽醌是一種細胞周期非特異性的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，結(jié)構(gòu)與阿霉素相似，能抑制DNA和RNA合成，心臟毒性小，主要用于惡性淋巴瘤、乳腺癌和急性白血病，對肺癌、黑色素瘤、卵巢癌和頭頸部癌也有一定療效[5]。目前有關(guān)鹽酸米托蒽醌對鼻咽癌作用效果及其機制研究少見報道，該實驗擬通過觀察鹽酸米托蒽醌在體外條件下對人低分化鼻咽癌細胞株CNE-2細胞生長增殖及凋亡的影響，并對機制進行初步探討，以證實其在鼻咽癌治療中的可能應(yīng)用前景。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人鼻咽癌細胞株CNE-2細胞由本實驗室自建，鹽酸米托蒽醌購于江蘇南通精華制藥有限公司， DEME培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，CCK-8細胞中增殖和細胞毒性檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物科技研究所，PI（碘化丙啶）購于Sigma公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與藥物處理

取對數(shù)生長期的CNE-2細胞以106 mL濃度接種于含10% 胎牛血清、100 IU/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DEME培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶壁貼滿細胞時，加入鹽酸米托蒽醌注射液，使樣品的藥物濃度分別為0.1、0.5、1、1.5、 2 μg/mL 。

1.3 CCK-8細胞中增殖和細胞毒性檢測試劑盒檢測

對數(shù)生長期的CNE-2細胞制成細胞懸液，接種于96孔板內(nèi)，每孔2×103個細胞，體積為100μL/孔，設(shè)陰性對照組和空白對照組。其余細胞三孔為1組，培養(yǎng)24 h后每孔加入不同濃度的鹽酸米托蒽醌繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，每孔加CCK-8試劑10 μL， 繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，在酶標儀上檢測樣品450 nm處吸光度OD值，計算細胞增殖率，細胞增殖率=（藥物處理孔的 OD 值-空白對照孔的 OD 值）/（陰性對照孔的 OD 值-空白對照孔的 OD 值） ×100%。

1.4 流式細胞術(shù)測定細胞內(nèi)藥物濃度

取對數(shù)生長期CNE-2細胞，不同濃度鹽酸米托蒽醌培養(yǎng)2 h后，棄上清，PBS洗1次，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后，PBS洗2次后，加入1 mL 4 ℃預(yù)冷PBS懸浮細胞，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)鹽酸米托蒽醌的熒光強度。（鹽酸米托蒽醌激發(fā)光譜630～650 nm，發(fā)射光譜685 nm）。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

藥物處理24 h后的細胞用不含EDTA的胰酶消化收集，PBS洗滌細胞2次，2 000 rpm離心5 min收集5×105細胞，加入500 L的Binding Buffer懸浮細胞后，加入5 L Annexin V-FITC混勻，再加入5L PI混勻，室溫避光反應(yīng)15 min后上流式細胞儀的檢測。

1.6 共聚焦檢測細胞內(nèi)藥物定位情況

對數(shù)生長期CNE-2細胞接種于共聚焦培養(yǎng)小皿內(nèi)24 h后，加入1 μg/mL藥物處理1 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌兩次后，將細胞與共聚焦顯微鏡下檢測細胞內(nèi)鹽酸米托蒽醌的熒光強度和定位情況。

1.7 統(tǒng)計方法

采用SPSS17.0軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸米托蒽醌對CNE-2細胞增殖的抑制作用

不同濃度的米托蒽醌分別作用于人鼻咽癌CNE-2細胞24 h和48 h，CCK-8法檢測它的增殖抑制效果。結(jié)果表明（見表1）：當時間不變時，隨著鹽酸米托蒽醌劑量的增大，對CNE-2細胞抑制作用增強，且呈劑量依賴性；在同一藥物濃度情況下，隨著藥物作用時間的延長，藥物對細胞株增殖的抑制作用也有所增強，呈時間依賴性。鹽酸米托蒽醌作用48 h后，1.5-2.0μg/mL各組的細胞增殖抑制率均超過80%。鹽酸米托蒽醌分別處理細胞24、48 h，其24 h和48 h半抑制濃度IC50值分別為1.89、0.098μg/mL。選擇24 h作為后續(xù)研究的作用時間。

3 討論

鹽酸米托蒽醌是一種抗腫瘤藥物，據(jù)文獻報道微克級濃度可抑制細胞增殖，亞毫克級濃度可使CHO、FL、SGC-7901等細胞株克隆形成能力下降[6]。在臨床上，其廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療，但鮮見關(guān)于鹽酸米托蒽醌用于鼻咽癌治療和作用機制的報道。

該研究結(jié)果顯示，鹽酸米托蒽醌能抑制人鼻咽癌細胞的生長和誘導(dǎo)細胞凋亡，并呈時間和劑量依賴性。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，低于1 μg/mL濃度鹽酸米托蒽醌作用的細胞6 h內(nèi)無明顯變化，藥物濃度大于1 μg/mL作用細胞6 h后，有細胞開始變形，細胞膜皺縮，呈現(xiàn)壞死的形態(tài)。流式結(jié)果顯示，藥物濃度0～1 μg/mL范圍內(nèi)，細胞對于藥物的內(nèi)吞藥物量與作用濃度成正比，當藥物濃度大于1.5 μg/mL時候，細胞的內(nèi)吞藥物量并沒有明顯變化，說明由于細胞自身耐藥蛋白的外排作用，使高濃度藥物并不能有效的進入細胞的內(nèi)部引起細胞程序性凋亡，而是通過藥物的毒性直接引起細胞壞死。

共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，鹽酸米托蒽醌的紅色的熒光明亮，主要以斑點狀分布于細胞質(zhì)內(nèi)，少量分布于細胞核。米托蒽醌藥物的細胞內(nèi)定位與細胞的藥物敏感性有著密切的關(guān)聯(lián)，有研究顯示[7]在兩種對米托蒽醌敏感程度不同的乳腺癌細胞系中，較為敏感的細胞中的藥物熒光更亮且呈斑點狀分布于細胞質(zhì)和細胞核中。復(fù)合納米粒的藥物通過增加乳腺癌細胞對鹽酸米托蒽醌的攝取量，使細胞內(nèi)藥物濃度增加而增強細胞的藥物敏感性[8]。

對于臨床的鼻咽癌治療，新的敏感化療藥物的選用一直是研究的熱點。鹽酸米托蒽醌屬于用于其他腫瘤化療的成熟藥物，如能有效的治療鼻咽癌，將能省去漫長的臨床試驗過程，且研究顯示藥物的細胞內(nèi)濃度和定位與細胞的藥物敏感性有直接的聯(lián)系，應(yīng)用此方法可以首先在體外對病人是否對藥物敏感進行評價，繼而進行有效化療免去不必要的痛苦。該研究結(jié)果顯示在低濃度藥物處理1 h后，鹽酸米托蒽醌能快速進入細胞內(nèi)聚集成斑點狀，且能有效的誘導(dǎo)細胞進入程序性凋亡。該研究為鹽酸米托蒽醌運用于鼻咽癌治療提供了體外的實驗依據(jù)，但是由于體外和體內(nèi)環(huán)境的差異以及鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展過程的復(fù)雜性，該藥物對鼻咽癌的治療效果和作用機制還有待進一步的研究。

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（收稿日期：2012-08-20）