Ascl2表達(dá)抑制對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

田音，朱蓉，汪榮泉

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[1]。EMT也是腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的一個(gè)非常重要的機(jī)制[2]。在EMT過程中表達(dá)下調(diào)的因子主要為上皮性標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)，表達(dá)上調(diào)的因子主要為間質(zhì)性標(biāo)志物如波形蛋白(vimentin)[3]。Ascl2(achaete scute-like 2)是一個(gè)堿性/螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)僅限于胎盤及Lgr5陽性的腸隱窩基底柱細(xì)胞(crypt base columnar cells，CBC cells)[4]。小鼠基因過表達(dá)和基因敲除模型研究揭示Ascl2是控制CBC細(xì)胞干性的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在小鼠腸上皮中的過表達(dá)可誘導(dǎo)腸隱窩過度增生及腸絨毛上異位隱窩的出現(xiàn)，而Ascl2基因誘導(dǎo)缺失可導(dǎo)致成體小鼠腸道Lgr5陽性的CBC細(xì)胞消失[4]。近來有研究發(fā)現(xiàn)，Ascl2在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的各個(gè)時(shí)期以及其他多種腫瘤中均表達(dá)上調(diào)[5-6]，在人結(jié)腸癌細(xì)胞系中干擾Ascl2的表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞周期G2/M期阻滯[7]，同時(shí)Ascl2作為Wnt信號(hào)在腸道內(nèi)的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，可抑制結(jié)直腸腫瘤中的Wnt信號(hào)通路，早期腸道腫瘤中Wnt信號(hào)通路的失調(diào)與Ascl2的過度表達(dá)相關(guān)[4]。因此我們?cè)O(shè)想Ascl2可能與結(jié)腸癌干細(xì)胞的干性相關(guān)。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，Ascl2在維持結(jié)腸癌干細(xì)胞自我更新方面發(fā)揮著重要作用[8]。有研究顯示，EMT及其逆轉(zhuǎn)過程MET(mesenchymal-epithelial transition)在胚胎發(fā)育、腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中起著重要的調(diào)節(jié)作用，EMT與正常及腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性的獲得有關(guān)[9-11]。Ascl2調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞干性的同時(shí)是否影響EMT目前尚不清楚。本研究對(duì)結(jié)腸癌HT29和LS174T細(xì)胞進(jìn)行Ascl2 RNA干擾并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，探討Ascl2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，人結(jié)腸癌細(xì)胞株LS174T由第三軍醫(yī)大學(xué)消化病研究所保種(均引自ATCC)；Macoy's 5A培養(yǎng)基購自Sigma公司；胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司；LipofectamineTM2000和Trizol試劑購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑購自大連寶生物工程有限公司；抗Ascl2單克隆抗體購自Millipore公司；抗E-鈣黏蛋白單克隆抗體購自Abcam公司；抗波形蛋白單克隆抗體購自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)購自碧云天公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG(H+L)購自中杉金橋生物公司。

1.2 干擾質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序 干擾質(zhì)粒shRNAAscl2/EGFP以及對(duì)照質(zhì)粒shRNA-Ctr/EGFP由武漢晶賽生物工程有限公司合成。Ascl2干擾序列為CCGCGTGAAGCTGGTGAAC[1]，由此設(shè)計(jì)合成的DNA模板引物為：上游引物5'-CACCGCCGCGTGA AGCTGGTGAACTTCAAGACGGTTCACCAGCTTC ACGCGGTTTTTTG-3'，下游引物5'-AGCTCAAAA AACCGCGTGAAGCTGGTGAACCGTCTTGAAGTT CACCAGCTTCACGCGGC-3'。采用Real-time PCR及Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒之后Ascl2的表達(dá)情況。

1.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立 HT-29和LS174T細(xì)胞用含10%胎牛血清的Macoy's 5A完全培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至50%~60%融合時(shí)，按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒48h后激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率均低于20%，進(jìn)一步行G418篩選以建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。HT-29和LS174T細(xì)胞的G418篩選濃度分別為800、400μl/ml，維持濃度分別為400、200μl/ml。

1.4 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將細(xì)胞消化、離心，吹散為單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞(100μl)，分別培養(yǎng)24、48、72、96h，然后加入5mg/ml MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h、吸棄上清，加入DMSO 150μl，震蕩10min，使結(jié)晶顆粒充分溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長處的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞消化、離心，吹散為單細(xì)胞懸液，以1000個(gè)/孔接種于35mm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿加入含20%血清的完全培養(yǎng)液2ml，并使細(xì)胞分散均勻，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每3d換液1次，共培養(yǎng)20d；加入2ml甲醇，固定20min，PBS洗3遍，每個(gè)培養(yǎng)皿加入Giemsa染液2ml，染色20min，PBS沖洗3遍，自然干燥，拍照，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)算克隆數(shù)。＞50個(gè)細(xì)胞計(jì)為1個(gè)克隆?？寺⌒纬陕?(陽性克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6 Real-time PCR檢測(cè)E-鈣黏蛋白和波形蛋白mRNA的表達(dá) 按Trizol試劑說明書方法提取總RNA，Real-time PCR引物由大連寶生物工程有限公司合成。E-鈣黏蛋白引物序列為：上游5'-TGCACTGCCCAGGAGCCAGA-3'，下游5'-TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3'，片段大小103bp；波形蛋白引物序列為：上游5'-TGAGTACCGGAGACAGGTGCAG-3'，下游5'-TAGCAGCTTCAACGGCAAAGTTC-3'，片段大小119bp。按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：37℃ 15min，85℃ 5s。Real-time PCR反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件為：95℃ 10s；95℃ 5s、60℃20s，40個(gè)循環(huán)；55℃ 10s，80個(gè)循環(huán)。

1.7 Western blotting檢測(cè)E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá) 采用SDS裂解緩沖液裂解HT-29和LS174T細(xì)胞，BCA法定量，取全細(xì)胞裂解液20μg，按照4∶1比例加入0.5mol/L DTT，煮沸5min變性，上樣，電泳，電轉(zhuǎn)，5% BSA室溫封閉2h，加入抗E-鈣黏蛋白抗體(1∶1000)或抗波形蛋白抗體(1∶300)，4℃過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)或兔抗山羊IgG(1∶10 000)，室溫孵育1.5h，洗膜，免疫復(fù)合物經(jīng)化學(xué)發(fā)光顯色，凝膠成像儀成像。采用Quantity-One軟件對(duì)條帶光密度值進(jìn)行分析，蛋白的相對(duì)定量結(jié)果以實(shí)驗(yàn)條帶光密度值/β-actin條帶光密度值表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立將構(gòu)建的載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明干擾質(zhì)粒的目的片段與預(yù)期完全相符。G418篩選后成功建立了shRNA-Ascl2/HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNAAscl2/LS174T和shRNA-Ctr/LS174T等4個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。

2.2 Ascl2干擾效果檢測(cè) 對(duì)HT-29(mock)、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-Ascl2/HT-29、LS174T(mock)、shRNA-Ctr/LS174T和shRNA-Ascl2/LS174T細(xì)胞進(jìn)行Ascl2 mRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒之后Ascl2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降(P＜0.01，圖1)。

2.3 Ascl2干擾后HT-29和LS174T細(xì)胞增殖情況MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，Ascl2干擾后的HT-29和LS174T細(xì)胞增殖率在72h及96h時(shí)間點(diǎn)明顯低于未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的HT-29和LS174T細(xì)胞(P＜0.05，圖2)。

2.4 Ascl2干擾后HT-29和LS174T細(xì)胞克隆形成情況 細(xì)胞培養(yǎng)20d后，轉(zhuǎn)染Ascl2干擾質(zhì)粒的HT-29和LS174T細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯少于未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞(P＜0.05，圖3)。

2.5 Ascl2干擾后HT-29和LS174T細(xì)胞E-鈣黏蛋白和波形蛋白的mRNA及蛋白表達(dá)情況 Real-time PCR結(jié)果顯示，干擾后E-鈣黏蛋白mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞，波形蛋白mRNA和蛋白表達(dá)均明顯低于未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞(P＜0.05，圖4、5)。

圖1 轉(zhuǎn)染Ascl2干擾質(zhì)粒后Ascl2 mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)情況Fig.1 Expression of Ascl2 mRNA (A) and protein (B) after transfected with shRNA-Ascl2 vector(1)P＜0.01 compared with mock and shRNA-Ctr

圖2 Ascl2干擾后HT-29和LS174T細(xì)胞增殖情況(MTT檢測(cè))Fig.2 Cell proliferation of HT-29 and LS174T cells after transfected with shRNA-Ascl2 vector(1)P＜0.05 compared with HT-29 and shRNA-Ctrl/HT-29; (2)P＜0.05 compared with LS174T and shRNA-Ctrl/LS174T

圖3 Ascl2干擾后HT-29和LS174T細(xì)胞克隆形成情況檢測(cè)Fig.3 The formed clone numbers of HT-29 and LS174T cells after transfected with shRNA-Ascl2 vector(1)P＜0.05 compared with mock and shRNA-Ctr

圖4 Ascl2干擾后HT-29和LS174T細(xì)胞E-鈣黏蛋白和波形蛋白mRNA表達(dá)情況Fig.4 Expression of E-cadherin(A) and vimentin(B) mRNA in HT-29 and LS174T cells after transfected with shRNA-Ascl2 vector(1)P＜0.05 compared with mock and shRNA-Ctr

圖5 Ascl2干擾后HT-29細(xì)胞(A)和LS174T細(xì)胞(B)E-鈣黏蛋白和波形蛋白蛋白表達(dá)情況Fig.5 Expression of E-cadherin and vimentin protein in HT-29 (A) and LS174T(B) cells after transfected with shRNAAscl2 vector

3 討 論

結(jié)腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，且預(yù)后不良，病死率較高[12]。結(jié)腸癌現(xiàn)有的治療方法包括手術(shù)切除、化療等均難以徹底根治，因此尋找新的治療方法勢(shì)在必行。目前隨著基礎(chǔ)研究成果向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化加速，以及腫瘤個(gè)體化治療、維持治療等觀念的更新，腫瘤已成為可控制的慢性病[4]。

我們前期的研究顯示，Ascl2在維持結(jié)腸癌干細(xì)胞的自我更新方面發(fā)揮著重要作用，Ascl2干擾后，HT-29和LS174T細(xì)胞的增殖減慢，細(xì)胞遷移和侵襲能力減弱，體外成瘤能力下降[9]。Ascl2作為Wnt信號(hào)通路的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，目前已被證實(shí)是正常成體腸干細(xì)胞的一個(gè)重要標(biāo)志物，并且控制著腸干細(xì)胞的命運(yùn)[5]，并有研究發(fā)現(xiàn)該因子在結(jié)腸癌標(biāo)本中表達(dá)上調(diào)[6-7]。

EMT是近年腫瘤發(fā)生過程中的一個(gè)研究熱點(diǎn)，有學(xué)者認(rèn)為它是腫瘤轉(zhuǎn)移的起始事件[13-15]，其中鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)是EMT發(fā)生過程中重要的分子事件[16]。但Ascl2與結(jié)腸癌細(xì)胞EMT是否相關(guān)及其機(jī)制目前尚不清楚。本研究將Ascl2的shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌HT-29和LS174T細(xì)胞，并通過G418篩選建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。MTT和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，Ascl2干擾后HT-29和LS174T細(xì)胞增殖速率和克隆形成能力均明顯下降，EMT相關(guān)蛋白E-鈣黏蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，波形蛋白mRNA和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，說明Ascl2干擾后逆轉(zhuǎn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT，提示Ascl2可能通過EMT促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，在結(jié)腸癌的惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，但Ascl2通過何種機(jī)制調(diào)節(jié)EMT尚不明了。

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