胚胎干細胞的應(yīng)用研究

甄 珍，郭 英，邊育紅，張艷軍（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

·現(xiàn)代醫(yī)學(xué)·

胚胎干細胞的應(yīng)用研究

甄 珍，郭 英，邊育紅，張艷軍*（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

胚胎干細胞（ES）是來源于早期胚胎內(nèi)細胞團（ICM）或原始生殖細胞（PGC）的一種多能細胞，具有體外無限復(fù)制和高度分化潛能的特性。目前，胚胎干細胞已逐漸應(yīng)用在胚胎干細胞體外測試（EST）與新藥開發(fā)，移植治療與細胞替代治療，轉(zhuǎn)基因動物與克隆上，并已取得了一定的研究成果。

胚胎干細胞；生物學(xué)特性；EST；新藥開發(fā)；移植治療；細胞替代

胚胎干細胞（ES）是來源于早期胚胎內(nèi)細胞團（ICM）或原始生殖細胞（PGC）的一種多能細胞。具有無限自我增殖的能力，即體外培養(yǎng)時ES細胞可以在一定的條件下保持不分化狀態(tài)且無限的自我復(fù)制。ES細胞還是一種全能干細胞，在特定條件下可向3個胚層的組織和細胞分化［1］。通常改變抑制ES細胞不分化狀態(tài)的培養(yǎng)條件，ES細胞就可以分化成多種細胞類型。ES細胞具有的這種能力在體外增殖并保持未分化狀態(tài)及其多向分化潛能的生物學(xué)特性，使其廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域，它的潛在醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值已成為世界范圍內(nèi)研究的熱點。特別是在建立EST（胚胎干細胞體外測試）、新藥開發(fā)、細胞組織器官的移植治療和替代治療、轉(zhuǎn)基因動物與克隆上有著廣闊的應(yīng)用前景。

1 EST與新藥開發(fā)

1.1 EST 根據(jù)ES細胞的特性，有研究者［2］提出了EST預(yù)測模型，經(jīng)過許多研究的驗證發(fā)現(xiàn)ECVAM（歐洲替代方法驗證中心）項目中提出的體外毒性試驗是合理的。關(guān)于EST作為體外篩選和評價受試物的方法也為ECVAM所接受［3］。

EST不僅可以研究藥物的細胞毒性，還可以研究胚胎發(fā)育毒性。EST與體內(nèi)測試相比，無需考慮藥物在動物體內(nèi)的代謝：與其他體外測試相比，不需大量的動物，其無限傳代的特性可以保證源源不斷的細胞供應(yīng)；與細胞毒性測試相比，ES細胞比成體組織對藥物毒性的敏感性要高，并且更容易檢測受試物和代謝產(chǎn)物的濃度［4］。

EST具體研究過程見參考文獻［2］。于洲等［5］在已經(jīng)建立的ES細胞經(jīng)體外誘導(dǎo)向心肌細胞分化的基礎(chǔ)上利用前期RA（視黃酸）體外誘導(dǎo)ES細胞向神經(jīng)細胞分化，建立ES細胞向神經(jīng)發(fā)育毒性評價的模型，通過評價了5－FU、DPH、青霉素的神經(jīng)發(fā)育毒性，初步驗證了該方法的有效性，從而對EST評價體系進行了豐富和完善。

1.2 新藥開發(fā) 在藥物研發(fā)過程中體外實驗雖然不能完全取代體內(nèi)實驗，但細胞實驗可以作為其他實驗的先導(dǎo)，為以后的體內(nèi)實驗提供行之有效的藥理藥代等數(shù)據(jù)，減少實驗所需動物，減低成本。目前藥物開發(fā)過程中所用的細胞大都來源于動物細胞或癌細胞，這些細胞不能完全反應(yīng)人體對藥物作用的效果。ES細胞可以誘導(dǎo)分化成任何組織類型的細胞，在藥物開發(fā)過程中可以提供大量用于實驗的細胞。EC（歐共體）建立了一項有針對性的研究項目“InVitroHeart”，旨在開發(fā)人ES細胞源心肌細胞的體外毒性試驗。將人心肌細胞培養(yǎng)與電生理和細胞毒性微傳感器平臺結(jié)合標準化，已達到快速篩選藥物的目的［6］。另外，ES細胞在胚胎毒性測試和肝毒性測試中也取得了很大進展［7］。

ES細胞還可用于創(chuàng)建動物模型，通過改變動物基因，建立與人類相似疾病的動物模型，應(yīng)用于藥物篩選的過程中，可以準確、快速的篩選出合適的藥物，目前這種方法已成為藥物篩選的手段之一［8］。近年來，興起的基因打靶技術(shù)是基于同源重組和ES細胞之上的一種可以定向改變生物體遺傳信息的實驗手段，同源重組是兩段含有相似核苷酸的DNA序列中自發(fā)交換遺傳信息的過程［9］?；虼虬屑夹g(shù)將含有已知序列的DNA片段與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，整合到受體細胞基因組中并得以表達的一種外源DNA導(dǎo)入技術(shù)［10］。ES細胞常用做基因打靶的靶細胞，利用基因打靶技術(shù)將外源DNA與ES細胞中的相似部分重組或靶向破壞等位基因，創(chuàng)建人類疾病的動物模型［11］。若將修飾過的ES細胞注入小鼠囊胚中，形成嵌合小鼠。從而在某些特定基因的研究過程中提供豐富的小鼠模型［12］，有研究人員［9］建立了500多個關(guān)于癌癥、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)疾病等人類疾病的小鼠模型，用于制藥企業(yè)的藥物發(fā)現(xiàn)和篩選。

2 移植治療和細胞替代治療

ES細胞在特定條件下可向3個胚層的組織和細胞分化。3個胚層包括外胚層、中胚層、內(nèi)胚層。外胚層可以分化產(chǎn)生外周、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、上皮系統(tǒng)的細胞等。中胚層可以分化為肌肉、骨、軟骨、造血和結(jié)締組織及上皮組織等。內(nèi)胚層可以分化成胰細胞、肝細胞等［13］。由疾病或外傷導(dǎo)致的細胞損傷都可以通過將ES細胞定向分化成的特異性組織細胞或器官來治療。由于心肌損傷導(dǎo)致的心臟病會使具有完整收縮功能的心肌細胞的數(shù)量減少，因此治療的關(guān)鍵是要增加具有完整收縮功能的心肌細胞數(shù)量。Min JY等［14］將經(jīng)過綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的ES細胞注入由于左冠狀動脈前降支結(jié)扎造成的心肌梗死（MI）引起的損傷心肌上，ES細胞移植6周后，MI動物心臟功能獲得顯著改善，且MI區(qū)域的心肌切片呈GFP陽性且有典型的條紋、心肌肌節(jié)α－肌動蛋白、心臟α－肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白Ⅰ的強陽性證實移植的細胞存活和向心肌細胞的分化。這些數(shù)據(jù)表明，ES細胞移植是可行的，有望成為治療心肌梗死等心肌損傷性疾病的新方法。

目前臨床上對于燒傷或創(chuàng)傷的患者主要是通過自身皮膚移植來治療，但是嚴重的燒傷或創(chuàng)傷的患者根本無法進行移植治療，ES細胞可誘導(dǎo)分化成表皮干細胞用于治療燒傷或創(chuàng)傷。劉愛軍等［15］將ES細胞源性的表皮干細胞移植到小鼠全層皮膚創(chuàng)傷面上，發(fā)現(xiàn)不僅能修復(fù)缺損表皮，而且有分化為汗腺樣、毛囊樣結(jié)構(gòu)的潛能。

ES細胞還可以用來治療喪失正常細胞功能的疾病如退行性病變、遺傳性疾病和腫瘤等。帕金森病（PD）是由于腦中多巴胺神經(jīng)元丟失而導(dǎo)致的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。迄今，無論是藥物還是手術(shù)治療都無法根治。而利用細胞替代治療，將ES細胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化成產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)細胞，再將這些細胞注入病變區(qū)域，就有可能治療帕金森病。體外誘導(dǎo)ES細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的方法可以采用經(jīng)典五步法，此方法通過模仿體內(nèi)ES細胞的生長分化環(huán)境，逐步改變ES細胞的培養(yǎng)液成分，添加不同的生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等，誘導(dǎo)ES細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化。這種方法簡單，對細胞毒性小，且分化成的多巴胺能神經(jīng)元較純。劉平等［16］利用無血清培養(yǎng)基的篩選和培養(yǎng)，在SHH和FGF8等細胞因子的共同作用下使其定向分化成為絡(luò)氨酸氫化酶陽性的神經(jīng)元。此外，與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)、基因修飾等方法也可產(chǎn)生純度較高的多巴胺能神經(jīng)元。

許多Ⅰ型糖尿病患者體內(nèi)，生成胰島素的β細胞及其他功能性細胞都被破壞。Lumelsky等［17］將ES細胞誘導(dǎo)分化成為能分泌胰島素和其他胰腺內(nèi)分泌激素的正常的胰島細胞，注入糖尿病鼠后形成了胰島樣結(jié)構(gòu)。如果將這些ES細胞分化成的胰島樣細胞移植入患者體內(nèi)，就可能使糖尿病從根本上得到治療。

3 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物與克隆

3.1 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物 轉(zhuǎn)基因動物是基因組中含有外源基因的動物。通過細胞融合、細胞重組等技術(shù)將外源基因?qū)刖?、卵子或受精卵中，通過生殖，在后代中形成可能會有攜帶目的基因的轉(zhuǎn)基因動物。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)方法是將目的基因注射到受精卵中，目前人們已成功的獲得了轉(zhuǎn)基因鼠、雞、豬、牛等動物。但此方法只能在個體水平上進行，且工作困難、效率低、周期長。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷提高，目前可以在細胞水平上篩選出最佳的細胞系，通過定向改變ES細胞，使其攜帶理想的目的基因，再將轉(zhuǎn)基因的ES細胞注入到受精卵中或?qū)⑥D(zhuǎn)基因的ES細胞與胚胎共培養(yǎng)，使ES細胞與正常胚胎形成嵌合體，在下一代中將出現(xiàn)計劃中的轉(zhuǎn)基因動物。這種方法無需大量的動物且周期短，極大地提高了動物的生殖效率。Wood SA等［18］將小鼠胚胎與ES細胞共同培養(yǎng)，形成嵌合胚，這種方法生產(chǎn)的小鼠ES細胞嵌合率很高，大大降低了實驗者的時間和精力。轉(zhuǎn)基因動物還可以用來生產(chǎn)基因工程藥物，將某些有預(yù)防或治療作用的藥用蛋白質(zhì)的基因提取出來，導(dǎo)入到轉(zhuǎn)基因動物中，就可以從轉(zhuǎn)基因動物的乳汁和血液中提取大量的這種藥用蛋白質(zhì)，來滿足臨床和試驗的需求。

3.2 克隆 體細胞核移植即克隆，是近年來出現(xiàn)的一種新的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。體細胞核移植是將外源基因與供體細胞共培養(yǎng)，使外源基因整合到供體細胞上，然后將供體細胞的細胞核移植到受體細胞（去核卵母細胞）上，構(gòu)成重建胚，在將其移植到假孕母體上分娩，得到轉(zhuǎn)基因動物。1996年英國制造了第一只體細胞核移植的克隆的動物綿羊多利。目前已經(jīng)成功克隆出牛、羊、狗等多種動物。有實驗者［19］利用核移植將牛的ES細胞核移植到去核卵母細胞中，形成重建胚，再移植入牛的受體子宮內(nèi)，后經(jīng)過超聲檢查，發(fā)現(xiàn)有胎兒存活。利用ES細胞進行核移植可以快速繁育優(yōu)良物種，加快動物的育種工作，在保護珍稀物種方面有重大意義。

4 現(xiàn)存問題

4.1 控制ES細胞定向分化 細胞分化是一個復(fù)雜的生理生化反應(yīng)過程，且ES細胞容易自主分化，對培養(yǎng)條件要求較高，對多種細胞因子、培養(yǎng)液環(huán)境等的影響敏感。要誘導(dǎo)ES細胞向預(yù)期方向分化，必須深入研究分化過程中所需的最佳環(huán)境。

4.2 移植帶來的免疫排斥反應(yīng) ES細胞移植時會因供體和受體的ABO血型抗原、主要組織相容性抗原、次要組織相容性復(fù)合物抗原的不同而誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)［20］。

4.3 ES細胞成瘤性 ES細胞可以無限增殖，如何控制其分化數(shù)量，使其達到足夠的治療數(shù)目且不會無限增殖而引起畸胎瘤仍需深入研究。

4.4 轉(zhuǎn)基因動物存活率 目前克隆的成功率較低，且克隆成功的動物多數(shù)表現(xiàn)出嚴重的生理或免疫機能缺陷等問題，最終導(dǎo)致死亡。因此，克隆技術(shù)仍需進一步的研究深入。

除去現(xiàn)有技術(shù)和研究的不足外，影響ES細胞應(yīng)用的最大問題即倫理問題，其關(guān)鍵問題是如何判定人格和生命。儒家學(xué)者認為人是有精神心理活動的有形體，胎兒不具備這些活動，所以不能稱之為人。也有很多社會倫理學(xué)家認為胚胎即意味著新的生命開始，其權(quán)利需要得到保護。但更多科學(xué)界人士更傾向于14d內(nèi)的胚胎不是人格的生命，不具備神經(jīng)系統(tǒng)和大腦，不會感覺到疼痛，故而不應(yīng)給予胚胎完全人權(quán)，可以用于生命科學(xué)的研究［21］。

［1］褚曉倩，王麗，Duya P，等．臍帶間充質(zhì)干細胞在細胞治療中的應(yīng)用潛能［J］．長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，28（3）：519－521．

［2］Scholz G，Genschow E，Pohl I，etal．Prevalidation of the embryonic stem cell test（EST）－A new in vitro embryotoxicity test［J］．Toxicology in Vitro：an International Journal Published in Association With BIBRA，1999，13（4－5）：675－681．

［3］Spielmann H，Liebsch M．Lessons learned from validation of in vitro toxicity test：from failure to acceptance into regulatory practice［J］．Toxicology in Vitro，2001，15（4－5）：585－590．

［4］Eisenbrand G，Pool－Zobel B，Baker V，et al．Methods of in vitro toxicology［J］．Food and Chemical Toxicology，2002，40（2－3）：193－236．

［5］于洲，徐海濱．體外胚胎干細胞神經(jīng)發(fā)育毒性評價模型的建立及有效性研究［J］．衛(wèi)生研究，2010，39（6）：685－688．

［6］Stummann TC，Bremer S．Embryonic stem cells in safety pharmacology and toxicology［J］．Advances in Experimental Medicine and Biology，2012，745：14－25．

［7］王娟，廖紅．干細胞定向分化在藥物研發(fā)中的作用及研究進展［J］．中國藥科大學(xué)學(xué)報，2011，42（3）：193－197．

［8］司書毅，張月琴，李元，等．藥物篩選：方法與實踐［M］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：343．

［9］Mak TW．Gene targeting in embryonic stem cells scores a knockout in Stockholm［J］．Cell，2007，131（6）：1027－1031．

［10］高正琴，邢華，李厚達．基因打靶技術(shù)的應(yīng)用研究［J］．動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)，2002，19（2）：10－13．

［11］趙震，孫開來．胚胎干細胞研究及應(yīng)用［J］．國外醫(yī)學(xué)（遺傳學(xué)分冊），2002，25（5）：249－252．

［12］Andrew D，Leavitt M D，Isla H D．Homologous recombination in human embryonic stem cells：a Tool for advancing cell therapy and understanding and treating human disease［J］．CTS，2011（4）：298－305．

［13］葛秀國，李吉霞，竇忠英．胚胎干細胞體外分化研究進展［J］．天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2009，16（3）：47－51．

［14］Min Jiang－yong，Yang Yinke，Converso K L，etal．Transplantation of embryonic stem cells improves cardiac function in postinfarcted rats［J］．Journal of Applied Physiology，2002，92（1）：288－296．

［15］劉愛軍，黃錦桃，李海標．胚胎干細胞源性表皮干細胞對小鼠全層皮膚缺損的修復(fù)［J］．解剖學(xué)報，2007，38（3）：296－299．

［16］劉平，鄒春林，關(guān)云謙，等．小鼠胚胎干細胞的體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化成酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元［J］．基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2004，24（3）：273－276．

［17］Lumelsky N，BlondelO，Laeng P，et al．Differentiation of embryonic stem cells to insulin－secreting structures similar to pancreatic islets［J］．Science，2001，292（5520）：1389－1394．

［18］Wood SA，PascoeW S，Schmidt C，et al．Simple and efficient production of embryonic stem cell－embryo chimeras by coculture［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences of the U－nited States of America，1993，90（10）：4582－4585．

［19］Stice SL，Strelchenko N S，Keefer C L，et al．Pluripotent bovine embryonic cell lines direct embryonic development following nuclear transfer［J］．Biology of Reproduction，1996，54（1）：100－110．

［20］任莉萍，曹小漢．胚胎干細胞的研究進展及應(yīng)用前景［J］．阜陽師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，23（1）：51－54．

［21］王延光．論干細胞研究中胚胎的道德地位［J］．中國醫(yī)學(xué)倫理學(xué)，2006，19（2）：6－10．

R331.2

B

1007－4813（2013）02－0319－03

2012－10－28）

中國博士后科學(xué)基金資助項目（200902281）；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）資助項目（2011CB505302）。

甄 珍（1987－），女，碩士研究生。研究方向：中藥藥理學(xué)。

*

張艷軍，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E－mail：zyjsunye＠163．com。