乙肝病毒大蛋白與乙肝病毒核酸檢測在抗病毒治療中的作用

耿坤靜 董愛英 王玉紅 武志強 盧淑蘭 劉書蘭 王麗

中國慢性乙肝患者感染者約占全世界的1/3［1］，乙型肝炎在中國感染率高，而且容易慢性化，引起肝硬化和原發(fā)性肝癌，已經(jīng)成為危害人類健康的社會性問題。慢性乙肝患者主要以抗病毒治療為主，因此，本研究通過乙肝患者抗病毒治療不同階段HBV-LP、HBV-DNA、PreS1Ag和HBV-M檢測結(jié)果，探討各檢測指標(biāo)間的相關(guān)性及臨床作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年3月至2010年4月在河北省保定市傳染病醫(yī)院住院和門診的符合抗病毒治療條件、并接受抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者120例，給予核苷(酸)類似物抗病毒治療。其中男79例，女41例;年齡16～55歲，平均年齡32.5歲。均符合2005年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)會與感染病聯(lián)合制定的中國慢性乙型肝炎防治指南的診治標(biāo)準(zhǔn)。120例患者在接受治療0、3、6、9和12個月時，分別采集血樣，及時提取血清置－70℃低溫冰箱冰凍保存以備測。

1.2 試劑與儀器 試劑:乙肝病毒標(biāo)志物(HBV-M)、PreS1Ag的定性、HBV-DNA定量診斷試劑盒(上?？迫A生物工程股份有限公司提供);HBV-LP診斷試劑盒(北京貝爾生物工程有限公司提供)。儀器:酶標(biāo)儀:Labsystem Dragon公司，MUL-TISKAN MK3型;洗板機:北京普朗新技術(shù)有限公司;熒光定量PCR儀:上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.3 檢測方法與結(jié)果判定 采用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測HBV-LP、PreS1Ag和 HBV-M;采用實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測HBV DNA。所有試劑盒均在有效期內(nèi)，嚴(yán)格按試劑說明書及臨床實驗操作規(guī)程操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗病毒治療不同階段進行 HBV-DNA、HBV-LP、preS1Ag和HBeAg陽性率比較 抗病毒治療前，HBV-DNA陽性率均顯著高于 PreS1Ag、HBeAg陽性率(P＜0.01)，而 HBV-LP和HBV-DNA陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);在抗病毒治療后，PreS1Ag、HBeAg與HBV DNA陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。在不同治療階段PreS1Ag和HBeAg陽性率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而PreS1Ag和HBeAg陽性率的變化趨勢一致，隨著抗病毒治療時間的延長，陽性率均在降低。在抗病毒治療后，HBV-DNA的陽性率明顯低于HBV-LP的陽性率，二者陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。隨著抗病毒治療時間的延長HBV-DNA和HBV-LP的變化趨勢一致，而且HBV-LP消退晚于HBV-DNA、PreS1Ag和HBeAg的消減，抗病毒治療12個月時，HBV DNA陽性率從100%降到61.40%，HBV-LP陽性率從100%降到80.70%。見表1。

表1 抗病毒治療過程中患者HBV-LP、HBV、DNA、preS1Ag和HBeAg陽性率比較 %

2.2 以HBV DNA為金指標(biāo)對HBV-LP的靈敏度、特異度、陰、陽性預(yù)測值比較 抗病毒治療不同階段共檢測528例次，在抗病毒治療前HBV-LP的靈敏度、陽性預(yù)測值最高(均為100%)。在抗病毒治療后，隨著抗病毒治療時間的延長，HBV-LP的靈敏度降低，特異度升高，陽性預(yù)測值降低。治療后12個月時，HBV-LP的靈敏度最低(94.28%)、特異性最高(52.94%)，均顯示HBV-LP是 HBV感染者體內(nèi)病毒復(fù)制的可靠指標(biāo)。見表2。

表2 以HBV DNA為金標(biāo)準(zhǔn)時HBV-LP的各指標(biāo)數(shù)據(jù) %

3 討論

目前，臨床上用于評估乙肝患者病毒復(fù)制與抗病毒療法的監(jiān)測指標(biāo)主要是HBV-DNA載量和HBeAg的血清轉(zhuǎn)換。雖然定量PCR方法監(jiān)測HBV-DNA已成為目前判定HBV復(fù)制最直接和可靠的指標(biāo)，但對于抗病毒治療患者來說，HBV-DNA陰性并不意味著病毒已經(jīng)清除了。因為肝內(nèi)cccDNA的降低遠遠低于血清HBV-DNA水平，血清HBV-DNA不能真實反映肝組織內(nèi)HBV復(fù)制的情況。同時HBeAg也不能反映干細胞內(nèi)HBV復(fù)制的情況，在HBeAg陰性的慢性乙肝患者中，由于HBV基因前C區(qū)或者CP區(qū)的變異［2］，導(dǎo)致HBeAg合成障礙，容易造成漏檢，患者HBeAg呈陰性而病毒仍在復(fù)制現(xiàn)象。

本研究中PreS1Ag陽性率低于HBV-LP陽性率可能由于HBV-LP試劑采用的是針對HBV-LP前S蛋白的構(gòu)象表位制備的單克隆抗體。PreS1Ag作為大蛋白的一部分，無法模擬其復(fù)雜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。在制作單克隆抗體時其序列會被折疊、卷曲而失去暴露表位的機會，這樣的低級結(jié)構(gòu)抗原制作出的單克隆抗體在實際應(yīng)用中便可以導(dǎo)致漏檢［3］。提示檢測含構(gòu)象前S區(qū)的HBV-LP比單獨檢測HBV PreS1Ag更能準(zhǔn)確反映出患者體內(nèi)病毒復(fù)制情況。

抗病毒治療前HBV-LP的靈敏度、陽性預(yù)測值最高(均為100.00%)，抗病毒治療后，隨著抗病毒治療時間的延長，HBVLP的靈敏度降低，特異度升高，陽性預(yù)測值降低。治療后12個月時，HBV-LP的靈敏度最低(94.28%)、特異性最高(52.94%)，均顯示HBV-LP是 HBV感染者體內(nèi)病毒復(fù)制的可靠指標(biāo)。

另在抗病毒治療前，HBV-LP和 HBV-DNA陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而在抗病毒治療后，HBV-LP和 HBVDNA陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。隨著抗病毒治療時間的延長HBV-DNA和HBV-LP的變化趨勢一致，而且HBVLP消退晚于HBV-DNA消減，這與陳曉明等［4］對拉米夫定治療患者的研究結(jié)果一致?？共《局委?2個月時，HBV-DNA陽性率從100%降到61.40%，HBV-LP陽性率從100%降到80.70%?？共《局委熯^程中HBV-LP持續(xù)陽性者，HBV-DNA出現(xiàn)轉(zhuǎn)陰的概率降低。慢性乙肝患者主要以抗病毒治療為主，理論上只有當(dāng)血液中HBV-DNA和HBV-LP都檢測不到了才意味著病毒核酸的復(fù)制、外膜蛋白的表達已經(jīng)處于終止?fàn)顟B(tài)，提示抗病毒治療的終點，因此，聯(lián)合檢測HBV-LP和HBV-DNA對抗病毒治療監(jiān)測愈后具有重要臨床意義。

1 賈繼東.乙型肝炎HBeAg陰性慢性乙型肝炎治療.中華肝臟病雜志，2005，13:539-126.

2 Lambert C，Mann S，Pranqe R.Assessnent of determ inants affecting the dual topology of hepadnaviral large envelope proteins.J Gen Virol，2004，85:1221-1225.

3 彭建明，李金明.病毒樣顆粒在免疫測定中的應(yīng)用研究進展.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2005，28:214-216.

4 陳曉明，楊梅芳，薛寒，等.乙型肝炎病毒大蛋白和DNA在抗病毒治療過程中的變化.中華傳染病雜志，2007，25:405-407.