亞硒酸鈉對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)及細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響*

呂小生，陳旭義，湯鋒武，蔣顯鋒，張 賽△

（1．樂亭縣醫(yī)院外四科，河北唐山063600；2．中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦系科，天津300162；3．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

膠質(zhì)瘤發(fā)生于神經(jīng)外胚層，是腦系腫瘤中治療效果及預(yù)后最差的一種，其發(fā)病機(jī)制不明。隨著腫瘤干細(xì)胞（tumor stem cell，TSCs）學(xué)說的提出［1］，并逐漸進(jìn)行了大量的深入研究，GSCs可能會(huì)為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供一種新的思路。硒是人體生命中的必需微量元素，近20年來，硒的抗癌作用逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)表明，硒化合物可通過多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用［2］?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）在硒的作用機(jī)制中非常重要，且本身亦介導(dǎo)硒化合物誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)選用人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過給予不同濃度的亞硒酸鈉侵染后，通過MTT實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)ROS含量，探討亞硒酸鈉對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細(xì)胞系 CD133磁珠分離的人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞由武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腦系科惠贈(zèng)。

1．1．2 分組 給予不同濃度的亞硒酸鈉對(duì)細(xì)胞進(jìn)行侵染，分為 3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：0．5μmol／L組，1．5μmol／L組，3．0μmol／L組；并設(shè)立空白對(duì)照組。

1．1．3 試劑與儀器 主要試劑與試劑 亞硒酸鈉、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5二苯基四氮唑溴鹽、羅丹明 123、DMEM、小牛血清（武漢博士德公司）、酶標(biāo)儀（芬蘭 Wellscan MK3公司）、熒光檢測(cè)儀（Fluostar，BMG，Germany）。

1．2 方法

1．2．1 四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞以1×104cells／well轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板，每孔200μl培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄原培養(yǎng)液，加入含不同濃度（0．5μmol／L、1．5μmol／L、3．0μmol／L）亞硒酸鈉的DMEM培養(yǎng)液200μl，對(duì)照組加入含等體積溶劑的DMEM培養(yǎng)液，每一濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。并設(shè)空白對(duì)照，比色時(shí)，空白孔調(diào)零，于加亞硒酸鈉后24 h檢測(cè)細(xì)胞活力。細(xì)胞孵育終止前，每孔加入新配制的 MTT（濃度為 5 g／L）溶液 20μl，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)作用4 h后棄上清液，每孔加200μl DMSO，振蕩10 min充分溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在550 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)，取6孔平均值。細(xì)胞抑制率按下列公式計(jì)算：抑制率＝（A對(duì)照-A測(cè)定）／A對(duì)照×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．2．2 細(xì)胞內(nèi)活性氧的測(cè)定 因?yàn)镠2DCFDA氧化時(shí)可產(chǎn)生熒光物質(zhì)，且熒光強(qiáng)度與ROS的濃度呈線性關(guān)系，故本研究采用此方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞用10%的小牛血清吹打混勻后以4×104cells／well孔接種于96孔板，細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再分別加入0．5μmol／L、1．5μmol／L、3．0μmol／L亞硒酸鈉培養(yǎng) 24 h，Hank′s液 清 洗 后，用 2′，7′-Dichlorodihydro fluorescein diacetate H2DCFDA（50μmol／L）孵育 20 min，以熒光檢測(cè)儀在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，吸收波長(zhǎng)450 nm下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示。采用采用 SPSS 11．5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析差異顯著性，以共同對(duì)照 t檢驗(yàn)比較組間差異。

2 結(jié)果

2．1 亞硒酸鈉對(duì)人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

MTT法檢測(cè)的吸光度值隨著亞硒酸鈉濃度的增高而逐漸降低，而且從數(shù)據(jù)上可看出，吸光度與亞硒酸鈉的濃度成一定的劑量反應(yīng)關(guān)系，各染硒組的吸光度值與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異（P＜0．01，表 1）。

2．2 亞硒酸鈉對(duì)人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響

將不同濃度的亞硒酸鈉侵染人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后，經(jīng)過熒光強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)可反應(yīng)出ROS的水平。各染硒組細(xì)胞（對(duì)照組、0．5μmol／L組、1．5μmol／L組、3．0μmol／L組）內(nèi)的熒光強(qiáng)度如下：79．53±3．39、286．42±9．58、126．39±4．17、347．17±7．29，從以上數(shù)據(jù)可以分析，經(jīng)過染硒處理后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)的ROS含量提高，與對(duì)照組比較后均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，表 2），雖然 1．5μmol／L組的 ROS含量出現(xiàn)了下降，但是繼續(xù)提高染硒劑量，ROS出現(xiàn)了大幅度提高。

Tab．1 Effects of sodium selenite on the cell growth inhibition（ˉx±s）

3 討論

上世紀(jì)70年代就有學(xué)者提出腫瘤是一種干細(xì)胞疾病的概念，1997年Dick在急性淋巴細(xì)胞白血病患者體內(nèi)分離出腫瘤干細(xì)胞，數(shù)量較少，僅占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的5%，但只有這群細(xì)胞具有自我更新和增殖分化潛能的干細(xì)胞特性［3］，從而獲得了腫瘤中存在著腫瘤干細(xì)胞的直接證據(jù)。腦膠質(zhì)瘤惡性度大，很多瘤體在手術(shù)中不能完全切除，且容易復(fù)發(fā)，放、化療效果不甚滿意，是神經(jīng)外科較為難處理的病種之一。繼有學(xué)者提出腫瘤干細(xì)胞學(xué)說之后，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究逐漸成為一個(gè)熱點(diǎn)，并已經(jīng)形成了較為成熟的腦膠質(zhì)瘤培養(yǎng)方法。

Tab．2 Fluorescence intensity of reactive oxygen species of human brain glioma stem cells treated with sodium selenite±s）

Tab．2 Fluorescence intensity of reactive oxygen species of human brain glioma stem cells treated with sodium selenite±s）

ROS：Reactive oxygen species*P＜0．05 vs control group

Group（μmol／L）Fluorescence intensity of ROS Control 79．53±3．39 Low dose（0．5） 286．42±9．58*Middle dose（1．5） 126．39±4．17*High dose（3．0） 347．17±7．29*

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于各種腫瘤相關(guān)因子的報(bào)道非常多，但由于腫瘤的發(fā)生是一種多因素相關(guān)的綜合疾病，與體內(nèi)的代謝、離子平衡、膜電位變化等息息相關(guān)，因此本實(shí)驗(yàn)選取微量元素的抗癌作用作為研究靶點(diǎn)。本研究以人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞作為研究對(duì)象，以具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的亞硒酸鈉作為干擾因素，結(jié)合硒元素的抑癌功能，從微量元素治療腫瘤的方向探討亞硒酸鈉對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的影響。

根據(jù)相關(guān)研究，硒化合物的抑癌機(jī)制與ROS關(guān)系密切，亞硒酸鈉可使70%的肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)有活性氧生成，CAT、SOD可大大降低凋亡的程度，這提示凋亡由活性氧介導(dǎo)。Stewart等［4］用亞硒酸鈉作用小鼠角質(zhì)細(xì)胞，檢測(cè)有82羥基鳥嘌呤生成以及細(xì)胞凋亡，因此推測(cè)凋亡是活性氧誘導(dǎo)。大量國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究提示活性氧在細(xì)胞凋亡中可能起到第二信使作用。故本研究所選取的測(cè)量指標(biāo)除了細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)外，還加入了ROS的檢測(cè)。

在對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的MTT試驗(yàn)中可以看到，隨著亞硒酸鈉劑量的增大，細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸受到抑制，并且有一定的劑量反應(yīng)關(guān)系，并且所有實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的抑制均出現(xiàn)了顯著性的變化，提示亞硒酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞存在著明顯的抑制作用。ROS是體內(nèi)存在的一類氧的單電子還原產(chǎn)物，包括超氧陰離子、過氧化氫、羥基和自由基等。在許多誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中ROS水平的激增已被證實(shí)是引起細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，其變化甚至早于細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變［5］。而大量的研究也發(fā)現(xiàn)ROS在腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡、相關(guān)酶類的促活等關(guān)系密切，在本研究中，隨著亞硒酸鈉濃度的提高，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞內(nèi)ROS的含量明顯增加，各實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)對(duì)比對(duì)照組均顯著性提高，這種增高的趨勢(shì)在1．5μmol／L組中雖然出現(xiàn)了一定的回落，但是繼續(xù)增加亞硒酸鈉劑量，則ROS又大幅度提高，這可能與試驗(yàn)操作本身有關(guān)，但是該實(shí)驗(yàn)重復(fù)了3次，雖然數(shù)據(jù)有一定的波動(dòng)，但是這種在中間濃度的回落表現(xiàn)都會(huì)出現(xiàn)，這也提示了亞硒酸鈉在對(duì)干細(xì)胞作用時(shí)可能涉及到

一些信號(hào)傳導(dǎo)分子的影響和反饋，但具體因素還需要深入的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。

本實(shí)驗(yàn)揭示了亞硒酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用和對(duì)其細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響，初步探討了亞硒酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤的治療作用，因本實(shí)驗(yàn)僅屬初步探討，在數(shù)據(jù)的研究中尚需很多實(shí)驗(yàn)工作，特別是亞硒酸鈉對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的影響是唯一的由硒元素決定的還是硒化合物的共同作用未作出研究，而且在具體的實(shí)驗(yàn)步驟中亦未對(duì)基因的檢測(cè)、凋亡的分析等進(jìn)行研究，所以本課題的基礎(chǔ)性值得更深層次的探索，具備較強(qiáng)的可持續(xù)性，因此顯得較有意義和目的性。

［1］ Reya T，Morrison S J，Clarke M F，et al．Cancer stem cells，cancer，and cancer stem cells［J］．Nature，2001，414（6859）：105-111．

［2］ Zhang W，Yan S，Liu M，et al．beta-Catenin／TCF pathway plays a vital role in selenium induced-growth inhibition and apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）cells［J］．Cancer Lett，2010，296（1）：113-122．

［3］ 黃 強(qiáng)．膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞研究［J］．實(shí)用腫瘤雜志，2004，19（4）：267-269．

［4］ Dick JE．Breast cancer stem cell revealed［J］．Proc Natl A-cad Sci USA，2003，100（7）：3547-3549．

［5］ Lau A T，Wang Y，Chiu JF．Reactive oxygen species：current knowledge and application in cancer research and therapeutic［J］．J cell Biochem，2008，104（2）：657-667．