鎘對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作及L-型鈣電流的影響*

陳 悅，劉秋慧

（1．河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，開封475004；2．鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450052）

鎘（cadmium，Cd）是一種有毒的重金屬元素，Cd對(duì)人體的影響正日益引起關(guān)注。Cd以低濃度存在于食物和香煙中，超生理范圍的Cd進(jìn)入機(jī)體內(nèi)可引起多種組織器官的損害［1］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，環(huán)境中Cd接觸與心血管疾病的發(fā)生有關(guān)［2］。亦有報(bào)道表明，0．1μmol／L的 Cd即對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生毒性，而同濃度對(duì)肝、腎并不產(chǎn)生毒性作用，說(shuō)明心肌細(xì)胞對(duì)Cd更敏感，更易受到Cd的毒害。Cd對(duì)動(dòng)物心臟毒性作用雖被確認(rèn)［3］，但Cd對(duì)心肌細(xì)胞電生理研究的報(bào)道極少。本研究應(yīng)用常規(guī)微電極和全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察氯化鎘（CdCl2）對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位和鈣電流的影響，以探討Cd對(duì)心室肌細(xì)胞的毒性作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物和試劑

清潔級(jí)健康成年SD大鼠30只（鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重 200～250 g，雌雄不限，隨機(jī)分 5組（n＝6）。1∶250胰蛋白酶（Sigma公司分裝）。CdCl2（遼寧嘉誠(chéng)精細(xì)化學(xué)品有限公司），用后置于干燥、潔凈螺紋口玻璃瓶中儲(chǔ)存。溶液配制：（1）有鈣臺(tái)氏液 （pH 7．3，mmol／L）：NaCl 143．0，KCl 5．4，CaCl22．8，MgCl20．5，NaHC0312．0，NaH2PO40．4，Glucose 5．5；（2）儲(chǔ)存液（mmol／L）：KOH 70，L-glutamic acid 50，KCl 40，Taurine 20，KH2PO420，MgCl2·6H2O 3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 1．5，pH 7．3。（3）電極液（Pipette solution，mmol／L）：KCl 20，KAspartate110，HEPES 5，MgCl2110，EGTA 10，Na2-ATP 5，用KOH調(diào)pH至7．2。所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1．2 方法

1．2．1 心室肌細(xì)胞分離及動(dòng)作電位記錄 將大鼠擊昏后開胸，取出部分心臟置于4℃MOPS緩沖液中，去除周圍結(jié)締組織，行主動(dòng)脈插管后固定于Langendorff灌流架上逆向灌流心臟，有鈣臺(tái)氏液 1．5 min，無(wú)鈣臺(tái)氏液6 min，酶溶液 13 min，儲(chǔ)存液3 min。灌流后，將心室肌剪成小碎塊，置于有儲(chǔ)存液的燒杯中。吸取上清液，以3 000 r／min離心5 min（離心半徑6 cm），棄上清液，加儲(chǔ)存液，放4℃的冰箱保存。

另取部分心室肌于37℃95%O2和5%CO2飽和的臺(tái)氏液中，用0號(hào)不銹鋼針固定于恒溫（36±0．5）℃，恒流（5 ml／min）灌流槽底部，以直徑0．5 mm雙極不銹鋼電極作細(xì)胞外刺激。用微操縱儀將電極插入心室肌細(xì)胞，顯示-70～-90 MV的靜息電位后，插入到細(xì)胞內(nèi)引出動(dòng)作電位，用MCP 2000程序顯示、處理分析。

1．2．2 膜片鉗全細(xì)胞鈣電流記錄 在室溫25℃下，吸取備用的細(xì)胞懸液（制備見方法1．2．1）1滴置入細(xì)胞浴槽中，置于倒置顯微鏡（Olympus lX70，Japan）工作臺(tái)上，待細(xì)胞沉降貼壁后，用不同的灌流液持續(xù)灌流，流速2 ml／s。選擇橫紋清晰、邊緣整齊、無(wú)收縮的細(xì)胞，通過(guò)微操縱器（Narishige，Japan）使阻抗為2～4 GΩ、內(nèi)充滿電極內(nèi)液的玻璃微電極與細(xì)胞表面形成巨阻抗封接。在正常臺(tái)氏液中加入20μmol／L 293 B和1μmol／L dofetilide以去除鉀電流的影響。給予指令電位從-30～＋60 mV，波寬為300 ms，頻率為1 kHz的刺激，從-30 mV開始激活的內(nèi)向電流即為L(zhǎng)型鈣能道電流（ICa-L）。電流信號(hào)通過(guò)0．1 GΩ探頭經(jīng)膜片鉗放大器的電流-電壓轉(zhuǎn)換輸入到模轉(zhuǎn)換卡變成數(shù)字A／D化頻率為10 kHz，低通濾波器濾波頻率為3 kHz。

1．3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以實(shí)驗(yàn)測(cè)值的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。動(dòng)作電位的各項(xiàng)參數(shù)采用單因素方差分析及各組與對(duì)照組的Dunnett檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 不同濃度的CdCl2對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響

在臺(tái)氏液中記錄到動(dòng)作電位后，穩(wěn)定0．5 h，以累積給藥法加入 CdCl2，使其終濃度分別 0．005，0．01，0．015 mmol／L，各灌流30 min。結(jié)果顯示，不同濃度的CdCl2對(duì)RP無(wú)影響，對(duì)跨膜電位表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，使動(dòng)作電位的各項(xiàng)參數(shù)一致減小。方差分析其抑制效應(yīng)有明顯的劑量依賴性，（P＜0．05，P＜0．01）。

Tab．1 Effects of the different concentration CdCl2 on APin rat myocardium（±s，n＝6）

Tab．1 Effects of the different concentration CdCl2 on APin rat myocardium（±s，n＝6）

RP：Resting potential；APA：Amplitude of action potential；Vmax：Maximum rate of depolarization；APD50：Action potential duration of repolarization 50%；APD90：Action potential duration of repolarization 90%*P＜0．05，**P＜0．01 vs control

Group RP／mV APA／mV Vmax／V／s APD50／ms APD90／ms Control -79．0±2．2 74．9±4．8 15．3±2．3 88．7±7．2 138．4±11．2 CdCl2（mmol／L）0．005 -78．1±2．5 66．5±6．7** 16．1±2．5 86．1±2．5 133．1±2．5 0．010 -81．3±4．2 50．3±2．4** 9．3±0．9* 76．3±4．2** 130．3±4．2*0．015 -80．7±3．6 46．2±3．1** 3．7±0．6** 63．7±3．6** 103．7±3．6**

2．2 不同濃度的CdCl2對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞L-型鈣電流的作用

本實(shí)驗(yàn)記錄24個(gè)心室肌細(xì)胞內(nèi)向ICa-L，每組為6個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中使用無(wú)Na＋、K＋離子的細(xì)胞外液，應(yīng)用電極內(nèi)液的高Cs＋離子抑制K＋電流。各組的記錄均從保持電位的 -30 mV階躍至 ＋60 mV，持續(xù)時(shí)間為300 ms，頻率為1 kHz。把配制成 0．005、0．010、0．015 mmol／L的 CdCl2分別加入到灌流液中，灌流30 min，觀察給藥前后ICa-L的變化。結(jié)果顯示，不同濃度的CdCl2對(duì)ICa-L均具有抑制作用（P＜0．05，P＜0．01，圖 1、表 2）。

Tab．2 Effects of the different concentration CdCl2 on ICa-L in rat myocardium（x±s，n＝6）

Tab．2 Effects of the different concentration CdCl2 on ICa-L in rat myocardium（x±s，n＝6）

*P＜0．05，**P＜0．01 vs control

Group ICa-L（pA／pF）Control 9．06±0．40 CdCl2／mmol／L 0．005 7．53±0．94*0．010 6．63±0．78**0．015 5．68±0．89**

Fig．1 Effects of CdCl2 on ICa-L in rat myocardium CdCl2

3 討論

ICa-L是心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程的重要離子電流之一，是參與形成平臺(tái)期的主要離子流［4］，若ICa-L內(nèi)向電流受到抑制，可使動(dòng)作電位平臺(tái)期縮短，從而使動(dòng)作電位時(shí)程也相應(yīng)縮短［5］。本實(shí)驗(yàn)觀察到不同濃度的CdCl2對(duì)心肌細(xì)胞靜息電位均無(wú)影響，但均可降低動(dòng)作電位的幅度，均能縮短動(dòng)作電位復(fù)極化的時(shí)程，此結(jié)果與Zhang J M，Kopanitsa M V的研究結(jié)果一致［4，5］，提示 Cd縮短動(dòng)作電位時(shí)程，可能與鈣內(nèi)流有關(guān)。

Cd減少ICa-L，與鈣通道阻滯劑維拉帕米作用一致，提示Cd是通過(guò)影響鈣通道而發(fā)揮此作用的，此現(xiàn)象可能是鎘對(duì)心肌毒性的重要機(jī)制之一，其詳細(xì)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

［1］ Wennberg M，Lundh T，Bergdahl I A，et al．Time trends in burdens of cadmium，lead，and mercury in the population of northern Sweden［J］．Environ Res，2006，100（3）：330-338．

［2］ Peters JL，Perlstein T S，Perrym J，et al．Cadmium exposure in association with history of stroke and heart failure［J］．Environ Res，2010，110（2）：199-206．

［3］ 賀超才，雷毅雄，蘆 茜，等．亞慢性鎘染毒致大鼠心臟損傷探討［J］．中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué)，2011，38（2）：95-98．

［4］ Zhang J M，Wu M N，Qi J S，et al．Amyloid beta-protein fragment 31-35 suppresses long-termpotentiation in hippocampal CA1region of rats in vivo［J］．Synapse，2006，60（4）：307-313．

［5］ Kopanitsa M V，Afinowi N O，Grant SG．Recording longterm potentiation of synaptic transmission by three-dimension almulti-electrode arrays［J］．BMCNeurosci，2006，7：61．