P-選擇素對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓致血管重構(gòu)的影響1）

孫 旭，邊云飛，劉改珍，孫亞麗，肖傳實

血管重構(gòu)（vascular remodeling，VR）是一個動態(tài)過程，包括細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡以及胞外基質(zhì)的合成、降解、重排；是血管對刺激復(fù)雜的動態(tài)反應(yīng)過程，包括信號的感受、傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)因子的合成釋放，最終使血管產(chǎn)生結(jié)構(gòu)的變化［1］。P-選擇素（P-selectin）是由血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的選擇素家族成員之一，主要介導(dǎo)白細(xì)胞在血管內(nèi)皮上的滾動和黏附［2］，發(fā)揮致炎作用。炎癥在高血壓血管重構(gòu)中起重要作用，包括血管壁通透性的改變，白細(xì)胞的滲出等［3］。因此，本研究以P-selectin基因敲除鼠為基礎(chǔ)，探討P-selectin在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）灌注致血管重構(gòu)中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 C57BL／6品系P-選擇素基因敲除小鼠（P-selectin-／-）由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心肺血管疾病研究所惠贈，微量泵采用Alzet model 1007D，AngⅡ購自美國Sigma公司，小鼠血壓測定使用Visitech BP2000 Blood Pressure Analysis System（美國）。兔抗轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、Smad2／3多克隆抗體購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，二步法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TGF-β1、Smad3引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 分別選取體重適合的18 g～20 g野生C57BL／6小鼠（Wild Type，WT）和C57BL／6遺傳背景相同的P-選擇素基因敲除小鼠，隨機分為WT＋PBS（陰性對照組）、P-selectin-／-＋PBS（空 白 對 照 組）、WT＋AngⅡ［1 5 0 0 ng／（min·kg），7 d，陽 性 對照 組］、P-selectin-／-＋AngⅡ［1 500 ng／（min·kg），7 d，實驗組］，每組各6只。

1.2.2 動物模型制備 采用血管緊張素Ⅱ微量泵灌注（7 d）構(gòu)建小鼠高血壓模型，術(shù)后第4天～7天測血壓，以確定血管緊張素Ⅱ灌注成功［4］。術(shù)后第7天，1%戊巴比妥麻醉小鼠，用肝素生理鹽水灌注動物，取胸主動脈，4%多聚甲醛固定。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 觀察蛋白在血管中的表達(dá)，并做定量分析用TGF-β1、Smad2／3一抗和HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗，結(jié)合DAB顯色觀察蛋白在組織中的表達(dá)。6張切片每張采圖3張，BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定其灰度值，并取平均值，定量分析各組間差異。

1.2.4 RT-PCR檢測 TGF-β1、Smad3 m RNA的表達(dá) 水 平用RNAiso Plus提取胸主動脈總RNA，微量分光光度計測定RNA量，調(diào)整RNA濃度使吸光度值（A260／280）在1.8～2.0。目的基因引物序列β-actin：上游5′-GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下 游5′-AGAGGTCTTT ACGG ATGTCA ACGT-3′，184bp。TGF-β1：上 游 5′-CGCAACAACGCCATCTAT-3′，下 游 5′-CCAAGGTAACG CCAGGAAT-3′，203bp。Smad3：上游5′-ACTA CAGCCATTCC ATTCC-3′，下游 5′-TCTCCAT CTTCACTCAGGTA-3′，106bp。將 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，行PCR擴增，條件：94℃預(yù)變性1 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)。凝膠成像儀保存圖像，用Quantity one分析測定灰度值，目的基因PCR產(chǎn)物相對表達(dá)含量為目的基因條帶灰度值／β-actin條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析One-Way ANOVA，方差齊使用LSD法，方差不齊使用Tamhane’s T2法，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠尾動脈收縮壓（SBP）變化 微量泵灌注后7 d測量各組小鼠尾動脈SBP，每只小鼠測量10次～20次取平均值。詳見圖1。

圖1 AngⅡ灌注7 d后各組小鼠收縮壓的變化

2.2 免疫組織化學(xué)染色 各組小鼠胸主動脈中膜TGF-β1、Smad2／3的表達(dá) TGF-β1、Smad2／3均定位于中膜層平滑肌細(xì)胞胞漿，在血管的內(nèi)皮細(xì)胞層亦有表達(dá)，陽性信號為棕黃色，結(jié)果以平均灰度值（MOD）表示，MOD值越低，蛋白含量越高。詳見表1。

表1 各組小鼠胸主動脈中膜TGF-β1、Smad2／3的表達(dá)±s）

表1 各組小鼠胸主動脈中膜TGF-β1、Smad2／3的表達(dá)±s）

組別 n TGF-β1 Smad2／3 WT＋PBS組 6 166.19±4.861） 126.77±4.331）KO＋PBS組 6 170.76±1.192） 132.45±4.372）WT＋AngⅡ組 6 102.88±5.17 101.72±7.60 KO＋AngⅡ組 6 167.98±3.651） 127.47±6.031）與WT＋AngⅡ組比較，1）P＜0.001；與 WT＋PBS組比較，2）P＜0.05

2.3 RT-PCR檢測（見圖2～圖4）

圖2 RT-PCR檢測血管TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)電泳圖

圖3 RT-PCR檢測血管TGF-β1 mRNA表達(dá)

圖4 RT-PCR檢測血管Smad3 mRNA表達(dá)

3 討 論

炎癥是血管重構(gòu)和纖維化的早期事件。在血小板表面表達(dá)有P-選擇素糖蛋白配體-1（PSGL-1），P-選擇素可通過與PSGL-1的結(jié)合，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞與血小板、內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用［5］，主要是白細(xì)胞在血管內(nèi)皮上的滾動和黏附過程［6］。

在高血壓進程中，血管緊張素Ⅱ的激活所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，對血管重構(gòu)有非常重要的作用。AngⅡ通過其ATⅠ受體來激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1／2和p38絲裂原活化蛋白激酶，進一步促進平滑肌細(xì)胞增殖和Ⅰ型膠原的合成［1］，亦可直接參與誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞的浸潤，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子（TGF-β）的釋放，刺激成纖維細(xì)胞分化，合成大量膠原等導(dǎo)致胞外基質(zhì)的沉積［7］。

研究表明，TGF-β1／Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與心血管疾病密切相關(guān)，在高血壓病、動脈粥樣硬化（AS）等疾病的發(fā)病過程中起重要作用［8］。TGF-β1是已知的最重要的致纖維化細(xì)胞因子之一［9］，而Smads是TGF-β1下游的一組重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。TGF-β1與其受體結(jié)合激活Smad2、3進入核內(nèi)，發(fā)揮正反饋作用［10］。TGF-β的作用有多重性，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn) TGF-β是細(xì)胞間質(zhì)蛋白合成的強刺激因子，TGF-β1／Smads信號通路活化能促進高血壓主動脈的重構(gòu)，且與ERK1／2、PARP、ET-1的上調(diào)等多種信號通路有關(guān)［11］，并能促進血管新生［12］。但也有研究稱TGF-β1／Smad3通道活化能抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥蛋白表達(dá)［13］，抑制TGF-β表達(dá)可提高表面黏附分子的表達(dá)，增強白細(xì)胞的黏附作用［14］，對心血管系統(tǒng)起保護作用。

本實驗結(jié)果顯示，胸主動脈中膜TGF-β1、Smad2／3的表達(dá)，WT（PBS）較P-selectin-／-（PBS）組升高明顯，WT（AngⅡ）較Pselectin（Ang Ⅱ）組 升 高 更 加 明 顯，而 P-selectin-／-（PBS）與P-selectin-／-（AngⅡ）組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，RT-PCR示TGF-β1、Smad3 mRNA與蛋白的表達(dá)趨勢基本一致。綜上推斷：P-選擇素和能夠上調(diào) TGF-β1、Smad3蛋白和mRNA的表達(dá)，主要通過加強TGF-β1／Smads信號通路的正反饋路徑促進血管的重構(gòu)，血管緊張素Ⅱ與P-選擇素在TGF-β1／Smads通路的正反饋路徑上有協(xié)同作用。

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