絲氨酰組氨酰賴氨酸三肽的合成*

徐常龍，曹小華，嚴(yán) 平，柳閩生，張愛東，張 巖

(1.九江學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西九江 332000;2.南京曉莊學(xué)院化學(xué)系，江蘇 南京 210017;3.華中師范大學(xué)農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430079)

含His-Lys序列的肽是一種具有不同生物功能的內(nèi)源性多肽，可由多種組織細(xì)胞表達(dá)和分泌，發(fā)揮多種生物學(xué)功能［1～4］，其化學(xué)合成是研究熱點(diǎn)［5～7］。研究發(fā)現(xiàn)絲氨酰組氨酰賴氨酸三肽［ZSer-His(Trt)-Lys-Z-OBzl，1］具有細(xì)胞生長(zhǎng)因子的功能［8］，并且由于其中絲氨酸具有羥基側(cè)鏈，在一定條件下可與糖或鹵代糖形成O-糖肽鏈［9］。糖肽是糖蛋白活性中心的結(jié)構(gòu)區(qū)域，在細(xì)胞免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)上可用于抗原與受體的識(shí)別作用，在生物學(xué)上可用于對(duì)細(xì)胞間相互作用和遺傳學(xué)研究［10］，因此，1的合成有重要的生物學(xué)意義。

本文利用液相合成法，L-絲氨酸(L-Ser)，L-組氨酸(L-His)和L-賴氨酸(L-Lys)經(jīng)活化后縮合合成了1(Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，IR和GC-MS確證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

XT4A型顯微熔點(diǎn)儀;Mer-curyPlus-400型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));Nicolet 470型紅外光譜儀;Trace MS型質(zhì)譜儀。

3［5］，A-B［6，11］按文獻(xiàn)方法合成;L-Ser，L-His，L-賴氨酸鹽，芐氧甲酰氯，N-羥基琥珀酰亞胺，N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，化學(xué)純，上海吉爾生化公司;其余所用試劑均為分析純，其中Et3N使用前重蒸，EtOAc和MeOH經(jīng)無水處理。

Scheme 1

1.2 合成

(1)Z-Ser-OH(A)的合成

在反應(yīng)瓶中加入L-Ser 6.0 g(57 mmol)和2 mol·L-1NaOH溶液33 mL，冰浴冷卻，攪拌下緩慢滴加芐氧酰氯12.8 mL(90 mmol)，滴畢，用2 mol·L-1NaOH 溶液(約 45 mL)調(diào)至 pH 8.0，反應(yīng)8 h。撤去冰浴，反應(yīng)過夜。用乙醚(50 mL)洗滌，冰浴下用濃鹽酸(約6 mL)調(diào)至pH 3.0(出現(xiàn)白色沉淀)，靜置(冰箱)3 h;過濾，濾餅用水(4×20 mL)洗滌，真空干燥過夜得白色固體A 8.5 g，產(chǎn)率62.2%，m.p.99 ℃ ～ 101 ℃;1H NMR δ:3.84～3.87(m，2H，CH2)，4.27(m，1H，CH)，5.10～5.14(m，2H，CH2)，7.28～7.38(m，5H，PhH);IR ν:3 424，3 338，3 329，3 211，3 030，1 746，1 692，1 600，1 535，1 401，911，750，697 cm-1。

(2)H-His(Trt)-OH(2)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入 L-His 3.0 g(19.3 mmol)和 CH2Cl215 mL，攪拌下加入 Me2SiCl22.33 mL(19.3 mmol)，于室溫反應(yīng) 5 h;加入 Et3N 2.68 mL(19.3 mmol)，反應(yīng) 15 min;依次加入 Et3N 1.39 mL(10 mmol)和三苯基氯甲烷(Trt-Cl)5.38 g(4.2 mmol)的 CH2Cl2(10 mL)溶液，反應(yīng) 2 h。加入過量無水MeOH，旋蒸脫溶，加水10 mL，用Et3N 調(diào)至 pH 8.0 ～8.5，加入 CHCl320 mL，過濾，濾液依次用水(20 mL)和乙醚(20 mL)洗滌，用混合溶劑［V(THF)∶V(H2O)=1 ∶1］重結(jié)晶，真空干燥48 h 得白色固體2 4.2 g，產(chǎn)率54.%，m.p.218 ℃ ～ 221 ℃;1H NMR δ:2.92 ～ 3.16(m，2H，CH2)，3.79 ～3.82(m，1H，CH)，6.85(s，1H)，7.12 ～7.41(m，5H，PhH);IR ν:3 414，3 050，2 966，1 629，1 597，1 491，1 246，1 230，753，701 cm-1。

(3)H-His(Trt)-OMe(B)的合成

在反應(yīng)瓶中加入甲醇8 mL，冰鹽浴冷卻至-10℃，攪拌下緩慢滴加SOCl21 mL，滴畢，加入2 4.0 g，于20℃反應(yīng)2 h;回流反應(yīng)(70℃ ～80℃)30 min(組氨酸完全溶解)。旋蒸脫溶，加無水乙醚30 mL～40 mL(大量晶體析出)，于冰箱中靜置1 h～2 h，抽濾，濾餅用無水乙醚洗滌，真空干燥得白色固體B 3.05 g，產(chǎn)率40.3%，m.p.118℃ ～ 121 ℃;1H NMR δ:3.10(s，3H，CH3)，3.15～3.30(m，2H，CH2)，4.13(m，1H，CH)，6.96(s，1H)，7.15 ～7.76(m，5H，PhH);IR ν:2 937，2 928，1 631，1 182，1 057 cm-1。

(4)H-Lys(Z)-OH(4)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入鹽酸賴氨酸10 g(56 mmol)的水(75 mL)溶液，堿式碳酸銅 12.7 g，攪拌下回流反應(yīng)4 h。加熱水(60℃ ～70℃)50 mL，過濾，濾液冷卻至0℃，用固體Na2CO3調(diào)至pH 9，恒溫(0℃)下滴加芐氧甲酰氯58 mL(約1 h，用固體 Na2CO3控制 pH≈9)，于室溫反應(yīng)12 h;過濾得藍(lán)色固體［12］，加水 200 mL，加入硫代乙酰胺8.42 g(112 mmol)，于50℃反應(yīng)3 h。用2 mol·L-1鹽酸調(diào)至 pH 2，煮沸5 min，過濾(除去CuS沉淀［13］)，濾液濃縮至 60 mL(析出白色沉淀)，過濾，真空干燥48 h得白色固體4 2.3 g，產(chǎn)率 20.1%，m.p.246 ℃ ～ 248 ℃;1H NMR δ:1.42 ～1.53(m，6H，CH2)，1.78 ～1.80(m，3H，CH2N)，3.12(m，2H，PhCH2)，3.31～3.51(m，2H，NH2)，7.28 ～ 7.38(m，5H，PhH);IR ν:3 345，3 338，3 319，3 054，3 034，1 582，1 513，1 419，940，1 692，747，697 cm-1。

(5)H-Lys-(Z)-OBzl(C)的合成

在反應(yīng)瓶中加入4 2.0 g(7.1mmol)和AcOEt 45 mL，攪拌使其完全溶解;依次加入Et3N 1.0 mL(7.1mmol)和 PhCH2Br 0.8 mL(35.7 mmol)，回流反應(yīng)6 h。抽濾［14］，濾餅用乙酸乙酯洗滌，合并濾液與洗液，依次用0.5 mol·L-1碳酸氫鉀溶液(2×20 mL)、飽和氯化鈉溶液(2×20 mL)和1.17 mol·L-1氯化鈉溶液(50 mL)洗滌至中性，用無水Na2SO4干燥，旋蒸脫溶得油狀液體C 2.1 g，產(chǎn)率 67.8%。

(6)1的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入A-B 9.74 g(15 mmol)，N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)1.78 g(15.5 mmol)和四氫呋喃21 mL，攪拌使其完全溶解;冰浴冷卻下滴加DCC(3.18 g)的 THF(6 mL)溶液，滴畢，反應(yīng)6 h。自然升至室溫，靜置過夜，過濾(除去N，N-二環(huán)已基脲)得溶液(E)備用。

在反應(yīng)瓶中加入C 1.82 g(4.5mmol)和THF 10 mL，攪拌使其完全溶解;加入E，冰浴冷卻下反應(yīng)2 d。旋蒸脫溶得黃色黏稠狀物，加乙酸乙酯20 mL，分別用飽和 NaHCO3溶液(3×20 mL)、檸檬酸溶液(3×20 mL)和飽和NaCl溶液(3×20 mL)洗滌，無水Na2SO4干燥，旋蒸脫溶后經(jīng)硅膠柱層析［洗脫劑:V(CH3Cl3)∶V(CH3OH)=5 ∶1］純化得淡黃色固體 1 1.3 g，產(chǎn)率 42.1%;1H NMR δ:3.38 ～3.48(m，8H，CH2)，3.85(m，1H，NH)，3.12(m，2H，PhCH2)，7.55 ～8.92(m，10H，PhH);EI-MSm/z:898(M+)，551，243，91。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

肽的化學(xué)合成法包括液相合成和固相合成法。兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)于較小的肽，液相反應(yīng)比固相反應(yīng)較方便，純化較容易。在肽的化學(xué)合成中，主要是酰胺鍵的形成和側(cè)鏈基團(tuán)的保護(hù)。肽的液相合成法發(fā)展至今，運(yùn)用較為廣泛的主要有混合酸酐法［16］、活化酯法［17］和縮合劑法［18］?？s合劑法中最為普遍使用的是二環(huán)已基碳二亞胺(DCCI)法，反應(yīng)中氨基的活化通常加入有機(jī)堿如三乙胺、N-甲基嗎啉等，能抑制副反應(yīng)且提高收率，本文采用此種方法。

在1的合成中，由于其中的氨基酸均為三官能團(tuán)的氨基酸，給合成帶來一定困難，因此選擇合適的保護(hù)基顯得極為重要，也是能否合成較純產(chǎn)物肽的關(guān)鍵。本文采用HOSu-DCCI法合成1，用N-甲基嗎林調(diào)節(jié)體系pH至9。在制備保護(hù)氨基酸時(shí)，考慮到1含有L-Ser，其側(cè)鏈羥基可和溴代葡萄糖反應(yīng)形成糖肽［19］，三肽上所有的保護(hù)基在糖肽形成后才脫除，由于O-糖所含肽鍵在酸性和堿性條件下均會(huì)斷裂，因此氨基酸的側(cè)鏈氨基和羧基的保護(hù)基，必須在溫和條件下容易脫去，且在脫保護(hù)反應(yīng)中對(duì)肽鏈的酰氨鍵和糖肽中O-糖肽鍵的影響很小。因此本文采用芐酯保護(hù)L-Lys的羧基，芐氧甲酰氯保護(hù)L-Ser的氨基和L-LysE位上的氨基，而芐基和芐氧甲酰基可在在中性條件用催化氫化法除去［7］，且氫化還原徹底，同時(shí)除掉了兩種保護(hù)基團(tuán)，簡(jiǎn)化反應(yīng)步驟。

在甲酯B的合成中，采用SOCl2?；疞-His的羧基，會(huì)產(chǎn)生一定的副反應(yīng)，Trt基在酸性條件下會(huì)脫除，因此控制SOCl2的加入量十分重要。本文對(duì)文獻(xiàn)［20］方法進(jìn)行了改進(jìn)，減少 SOCl2用量，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，并在反應(yīng)中升溫回流之前，加入NaHCO3調(diào)節(jié)體系pH至中性，制得咪唑基上的氨基保護(hù)的組氨酸甲酯。

本文合成了具有細(xì)胞生長(zhǎng)因子功能的絲氨酰組氨酰賴氨酸三肽，以其為原料可合成具有重要生物功能的分子糖肽。為研究其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響狀況奠定了基礎(chǔ)，提供了其在醫(yī)學(xué)及免疫學(xué)中應(yīng)用的可能。

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