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      米非司酮對(duì)孕酮防護(hù)PC12細(xì)胞氧糖剝奪損傷的影響*

      2013-03-25 07:59:24吳春平王國紅李東亮
      關(guān)鍵詞:氧糖司酮孕酮

      吳春平,王國紅,張 勇,李東亮

      (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室,河南新鄉(xiāng)453003)

      孕酮(progesterone,PROG)是性腺分泌的甾體激素,現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)它也可在神經(jīng)系統(tǒng)生成并影響神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能,被稱為神經(jīng)活性甾體(neuroactive steroid)。本實(shí)驗(yàn)室先前已經(jīng)證明PROG可減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,IRI)引起的腦水腫,降低血腦屏障通透性,促進(jìn)腦IRI大鼠的行為恢復(fù)[1]。最近本室在體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞證明孕酮可減輕氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)對(duì)神經(jīng)元的損傷。然而孕酮的防護(hù)作用是通過核受體介導(dǎo)的基因途徑,還是通過膜受體介導(dǎo)的非基因途徑目前尚不清楚[2]。本文在PC12細(xì)胞的OGD損傷模型,觀察孕酮核受體拮抗劑米非司酮(mifepristone,MIF)阻斷孕酮核受體前后細(xì)胞形態(tài)、存活率、培養(yǎng)液中葡萄糖含量的變化,探討核受體介導(dǎo)的基因途徑在孕酮抗OGD損傷中所扮演的角色。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞株購于上海中科院細(xì)胞庫。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)購自美國 Invintrogen公司;DMEM培養(yǎng)基(無糖、無酚紅)、孕酮、米非司酮和2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide(XTT)購于美國 Sigma公司;葡萄糖測定試劑盒購于上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;胎牛血清購自杭州四季青公司。

      1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

      PC12細(xì)胞采用含10%胎牛血清、100 U/ml芐青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分5組,正常對(duì)照組(normal):常氧常糖培養(yǎng);OGD模型組(model):接種24 h后行OGD處理30min,后復(fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)24 h;PROG組:OGD和復(fù)氧復(fù)糖期間培養(yǎng)基中含10 nmol/L孕酮,余同 model組;PROG+MIF組:10μmol/L MIF預(yù)處理 30 min后,按PROG組操作進(jìn)行;MIF組:不行PROG處理,余同PROG+MIF組。各組按上述處理后進(jìn)行各指標(biāo)檢測。

      1.3 PC12細(xì)胞OGD模型制備

      參照文獻(xiàn)[3]對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪處理。細(xì)胞培養(yǎng)液更換為無糖無酚紅DMEM培養(yǎng)基后,放入低氧艙中,快速充入含95%N2、5%CO2混合氣體,低氧艙氧濃度低于1%開始計(jì)時(shí),持續(xù)低氧30 min,低氧過程中環(huán)境溫度維持在37℃。

      1.4 HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)

      細(xì)胞以5×104cells/ml的密度接種于24孔板中,接種24 h后隨機(jī)分組并按上述操作行各組處理,倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化,然后行HE染色。

      1.5 XTT法檢測細(xì)胞活力

      細(xì)胞以5×104cells/ml的密度接種于96孔板,24 h后隨機(jī)分組,每組設(shè)5復(fù)孔,各組行上述處理。XTT檢測時(shí),每孔加入預(yù)溫37℃50μl的XTT工作液,培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。然后用ELX-800(Bio-Tek)酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值,測定波長450 nm,參考波長650 nm。計(jì)算各組細(xì)胞活力(Viability)。計(jì)算公式如下:細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組吸光度-空白組吸光度)/(對(duì)照組吸光度-空白組吸光度)×100%

      1.6 臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)計(jì)數(shù)活細(xì)胞

      各組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化30 s,完全培養(yǎng)基終止消化,吹打成的單細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液1∶1混勻,臺(tái)盼藍(lán)著色的細(xì)胞為死細(xì)胞,活細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)每毫升細(xì)胞懸液中活細(xì)胞數(shù)(viable count)。

      1.7 葡萄糖含量的測定

      每孔取10μl培養(yǎng)液,用氧化酶法測定培養(yǎng)基中葡萄糖含量,嚴(yán)格按試劑盒操作流程進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算方法:葡萄糖(mmol/L)=樣本吸光度(A)/校準(zhǔn)吸光度(A)×校準(zhǔn)液濃度。

      1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組之間顯著性檢驗(yàn)用單因素方差分析,兩兩比較均采用LSD檢驗(yàn)。

      2 結(jié)果

      2.1 米非司酮對(duì)孕酮防護(hù)氧糖剝奪PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

      倒置鏡下normal組PC12細(xì)胞多呈梭型或三角形,折光性強(qiáng),兩極伸出較長突起,部分突起可發(fā)出分枝并交織成網(wǎng)狀;HE染色顯示,與normal組相比model組細(xì)胞皺縮變圓,折光性下降,突起減少或消失,部分細(xì)胞裂解成碎片,細(xì)胞密度明顯降低,胞質(zhì)濃縮,胞核固縮呈黑色,細(xì)胞邊集,中央細(xì)胞稀疏。PROG組細(xì)胞大部分仍呈梭形,胞體皺縮減輕,仍有細(xì)短突起,細(xì)胞密度較model組增加。PROG+MIF組和MIF組的細(xì)胞形態(tài)和密度與model組相似,表明MIF可阻斷孕酮改善OGD細(xì)胞形態(tài)損傷的作用。

      2.2 米非司酮對(duì)孕酮防護(hù)氧糖剝奪PC12細(xì)胞活力的影響

      XTT法檢測細(xì)胞活力結(jié)果顯示,model組細(xì)胞活力明顯低于 normal組(P<0.01),PROG組則顯著高于 model組(P<0.01),PROG+MIF組和MIF組的細(xì)胞活力明顯低于PROG組(P<0.05),而與 model組無顯著性差異(P>0.05)。孕酮可顯著提高OGD后PC12細(xì)胞活力,具有較好的防護(hù)作用,而米非司酮阻斷了孕酮91.8%±3.2%的防護(hù)作用 (表1)。

      2.3 米非司酮對(duì)孕酮防護(hù)氧糖剝奪PC12活細(xì)胞數(shù)的影響

      Model組的活細(xì)胞數(shù)明顯低于 normal組(P<0.05)。PROG組的活細(xì)胞數(shù)較model組顯著增多(P<0.05)。PROG+MIF組的活細(xì)胞數(shù)與model組無明顯差異(P>0.05),顯著低于孕酮組 (P<0.05),米非司酮拮抗了孕酮 85.0%±2.6%的作用。MIF組與model組、PROG+MIF組之間均無顯著差異(P>0.05,表 1)。

      2.4 孕酮和米非司酮對(duì)氧糖剝奪PC12細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖含量的影響

      Model組細(xì)胞培養(yǎng)基中的葡萄糖含量顯著高于normal組(P<0.05)。PROG組明顯低于 model組 (P<0.05)。PROG+MIF組和MIF組明顯高于PROG組 (P<0.05),與model組相比無明顯差異(P>0.05,表 1)。

      Tab.1 Effects of progesterone and mifepristone on cell viability,viable count and glucose content in themedium

      3 討論

      傳統(tǒng)認(rèn)為孕酮可通過位于細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)的受體,刺激基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成,產(chǎn)生基因效應(yīng)。近年來的研究表明孕酮也可通過膜受體將細(xì)胞外信號(hào)傳遞給胞內(nèi)第二信使,發(fā)揮非基因效應(yīng)。目前雖然在很多物種克隆出孕酮膜受體的cDNA和重組蛋白,然而膜受體的本質(zhì)到現(xiàn)在還不完全明確。我們前期工作表明孕酮可以增加氧糖剝奪PC12細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT3的表達(dá),減少PC12細(xì)胞的死亡[4]。但它是通過基因效應(yīng),還是通過非基因效應(yīng)目前并不明了,國內(nèi)外也少有報(bào)道。人工合成的米非司酮(RU486)是孕酮的特異性核受體阻斷劑,對(duì)孕酮核受體有很高的親和力,拮抗孕酮的作用很強(qiáng),常被用于研究甾體激素受體作用機(jī)制的工具藥[5]。本實(shí)驗(yàn)證明PROG組細(xì)胞活力顯著高出OGD模型組(P<0.01),而預(yù)先用孕酮的核受體阻斷劑米非司酮處理則可顯著拮抗孕酮的作用,細(xì)胞活力下降到model組水平(P>0.05),米非司酮對(duì)孕酮的阻斷作用達(dá) 91.8%±3.2%。臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)計(jì)數(shù)活細(xì)胞結(jié)果與XTT檢測結(jié)果一致,米非司酮可阻斷孕酮85.0%±2.6%的作用。用葡萄糖氧化酶法測定培養(yǎng)基中的葡萄糖含量,可間接反映細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗情況。結(jié)果表明model組培養(yǎng)基中的葡萄糖含量顯著增高,PROG組則顯著降低,PROG+MIF組明顯升高,表明孕酮減少細(xì)胞死亡,增加了葡萄糖的消耗,而這種防護(hù)作用被米非司酮所拮抗。上述結(jié)果表明孕酮對(duì)OGD損傷PC12細(xì)胞的防護(hù)作用可能主要是通過核受體介導(dǎo)的基因效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。

      [1] 李東亮,趙紅崗,王東霞,等.孕酮對(duì)腦缺血再灌注大鼠紋狀體水、鈉、鉀及鈣含量的影響[J].中國病理生理雜志,2001,17(10):1012-1015.

      [2] Kilic F,Kashikar N D,Schmidt R,et al.Caged progesterone:a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone[J].J Am Chem Soc,2009,131(11):4027-4030.

      [3] Li H,Hu J,Ma L,et al.Comprehensive study of baicalin down-regulating NOD2 receptor expression of neurons with oxygen-glucose deprivationin vitroand cerebral ischemiareperfusionin vivo[J].Eur JPharmacol,2010,649(1-3):92-99.

      [4] 侯志慧,王國紅,吳春平,等.孕酮對(duì)氧糖剝奪損傷的PC12細(xì)胞的防護(hù)作用[J].中國病理生理雜志,2012,28(2):269-273.

      [5] Butts C L,Shukair SA,Duncan K M,et al.Progesterone inhibitsmature rat dendritic cells in a receptor-mediated fashion[J].Int Immunol,2007,19(3):287-296.

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